基因工程原理 第4章 质粒和噬菌体载体的基础生物学.ppt

* 一．氯化铯密度梯度离心法 　　在细胞裂解及DNA分离的过程上，大分子量的细菌染色体DNA容易发生断裂形成相应的线性片段，而质粒DNA则由于其分子量较小、结构紧密，因此仍能保持完整的状态。　　氯化铯-EtBr密度梯度离心法，就是根据这一差别建立的纯化质粒DNA的经典技术。当将含有溴化乙锭（EtBr）的氯化铯（CsCl）溶液加到清亮的大肠杆菌裂解液中时，EtBr扁平分子便会通过在碱基对之间的嵌入作用而结合成DNA分子链上，并因此导致双螺旋结构发生解旋反应。线性的或开环的DNA分子，例如大肠杆菌染色体DNA片段，可结合相当大量的EtBr分子。而像质粒这样的共价闭合环状的DNA（cccDNA）分子， EtBr分子的结合数量相对较少。在DNA-EtBr复合物中，结合的EtBr分子数量越多，其密度也就越低。通过氯化铯密度梯度离心之后，根据它们的不同密度，就会平衡在不同的位置，从而达到纯化质粒DNA的目的 * 现在最受欢迎的是Binrnboim和Doly发明的碱裂解法。 二．碱变性法 　　这种方法是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA片段之间，在拓扑学上的差异而发展出来的。　　通过加热，尤其是在pH值介于12.0～12.5这个狭窄的范围内，连接DNA互补链之间的氢键会被断裂，但由于cccDNA的双螺旋主链骨架的彼此盘绕作用，互补的两条链仍然会紧密地结合在一起。通过致冷或恢复中性pH值更会迅速地复性，复性迅速而准确。　　线性的染色体DNA分子，在此过程中彼此已经分离开来的互补链之间的复性作用就不会那么迅速而准确。它们聚集形成的网状结构，通过离心分离便会与变性的蛋白质及RNA一道沉淀下来。仍然滞留在上清液中的质粒cccDNA则可用酒精沉淀法收集。 　三．微量碱变性法 　　微量碱变性法具有简单快速、经济实惠的优点，是当前分子生物学及基因工程研究工作中最常用的一种分离纯化质粒DNA的方法，现将其操作程序及其原理简述如下：　　第一步，取1.5毫升含有质粒的大肠杆菌过夜培养物加在微量离心管中，离心收集细胞沉淀，并用100微升冰冷的溶液I[50mM葡萄糖，25Mm Tris-HCl（Ph8.0），10Mm EDTA，4～5mg溶菌酶/mL]重新悬浮。将反应混合物在室温下静置5分钟，让溶菌酶充分发挥效力，促使大肠杆菌细胞变得脆弱而易于裂解。溶菌酶对反应液的pH值有很大的依赖关系， TrisHCl缓冲体系和适量的葡萄糖而有利于pH的调节。乙二胺四乙酸（EDTA），可抑制酸酶的活性，从而保护质粒DNA免被降解。　　第二步，加入200微升冰冷的溶液Ⅱ[0.2N NaOH, 1.0%SDS]，缓缓混匀后，置室温下5分钟。SDS的作用在于使细胞裂解，以释放质粒及染色体的DNA。在高pH值（12.0～12.5）的反应体系中，则会使线性缺口的质粒DNA以及线性的染色体DNA片段被选择性地变性，而共价闭合环状的质粒DNA则不会受影响。　　第三步，加入150微升冰冷的pH4.8的3M醋酸钠，缓缓震荡10秒钟后，放置在冰浴中5分钟。PH4.8的醋酸钠溶液降低了反应混合物中的pH值，起到中和作用，从而使线性的质粒及染色体DNA复性，并聚集成不可溶的网络状聚合物。同时高浓度的醋酸钠亦会引起蛋白质-SDS复合物和高分子量的RNA分子发生沉淀。通过离心处理，便可把网络状的DNA聚合物同变性的蛋白质-DNA及RNA等以复合物形式沉淀出来，从而使质粒DNA得到纯化。　　第四步，将上述离心所得的主要是含有质粒cccDNA上的清液，用苯酚抽提数次除去蛋白质污染物，最后按酒精沉淀法收集质粒DNA。　　按照这种方法制备的质粒DNA，其纯度完全可以满足常规的基因克隆实验要求。如有必要亦可用凝胶过滤法作进一步的纯化。 * 　四．影响质粒DNA产量的因素 　（1）寄主菌株的遗传背景　　大肠杆菌寄主菌株的正确选择，是获得高产量质粒DNA的重要条件之下。为此一般建议使用endA基因发生突变的（endA1）大肠杆菌寄主菌株，例如DH5α、JM109以及XL1-Blue等。EndA基因突变的结果，使大肠杆菌寄主细胞失去了合成具有功能活性的核酸内切酶I的能力，从而增进了所含有的质粒DNA分子的稳定性。所以从这类寄主细胞中制备的质粒DNA不仅在质量上有所改进，同时在产量上也得到了提高。　（2）质粒的拷贝数及分子大小　　细菌培养物中质粒DNA之理论产量，可以根据公布的质粒的拷贝数和分子量大小（bp）及每毫升培养物中的大肠杆菌细胞总数三者相乘得出（表4-3）。质粒分子拷贝数的多寡和质粒分子大小是决定其DNA产量的重要因素之一。 * 在克隆的早期，使用的都是天然的克隆载体，例如Col E1 和 Psc101. 尽管这些载体较小并对常用的限制性内切酶有单一位点，但它们可供选择转化