酶工程第四章酶的提取与分离纯化详解.ppt

* 电泳胶实例 * 四、等电聚焦 ( isoelectric focusing，IEF ) 利用蛋白质具有不同等电点的特性，以聚丙烯酰胺为电泳支持物，在其中加入载体两性电解质（商品名：Ampholine，一种含有各种连续 pI 的小分子混合物）的电泳方法称聚丙烯酰胺等电聚焦电泳（IEF）。 * 1. 原理 两性电解质载体在电场作用下，按各自pI形成从阳极到阴极逐渐增加的平滑和连续的pH梯度。蛋白质在此pH梯度凝胶中泳动，当迁移至pH值等于pI处时不再泳动，被浓缩成狭窄的区带。 * 两性电解质载体(carrier ampholytes) (1)易溶于水，有足够的缓冲能力——以便保 持稳定的pH梯度。 (2)导电性能好——以保持电场强度的均匀性。 (3)分子量小——电泳后易分离除去。 (4)化学组成不同于蛋白质——不干扰测定。 * 等电聚焦电泳 * 2. 操作： 1）凝胶 配制：凝胶浓度T为5％~7.5％（C=3% 左右） 2）加样：任意位置 * 3）电泳： 阳极：磷酸溶液 电极溶液 阴极：NaOH溶液 只有在凝胶两端给予高电压（600V）时，才能获得较好的分辨率。而高电压的维持需要有效的凝胶冷却系统。 4）固定及染色：TCA固定，考马斯亮蓝染色。 * 5）等电点测定： Marker与未知样品同时电泳染色后，以pH值为纵轴，距阴极距离为横轴，做pH梯度标准曲线，据未知蛋白迁移距离可推知pI。 IEF测定蛋白质pI * 第四节 酶的浓缩、干燥与结晶 一、酶的浓缩 (一)蒸发浓缩 图 4-60 减压蒸发浓缩的简易装置 1蒸馏瓶2毛细管3螺旋夹4橡皮管5温度计6出水口7冷凝器8进水口9连接管10抽气口11接收瓶 * （二） 超滤浓缩 超滤(ultrafiltration) 浓缩以压力差为动力，将待浓缩溶液通过超滤膜，酶分子较大被滞留，水分子和小分子选择性透过，达到浓缩目的 。 图4-61 酶的超滤浓缩 * （三）吸水剂 1.胶过滤浓缩 ： 利用葡聚糖凝胶Sephadex G-25或G-50等的吸水特性。将干胶直接加入样品溶液，吸水膨润后，再过滤或离心分出浓缩的酶液。 * 2.聚乙二醇浓缩： 聚乙二醇（polyethylene glycol），简称PEG 。 利用PEG的吸水特性。将PEG涂于装有酶溶液的透析袋上，置于4℃下，干PEG粉末吸收水和盐类，酶溶液即被浓缩。 一般用分子量大的PEG,如PEG 6,000和PEG 20,000，以防止PEG进入蛋白质溶液。 * （四）反复冻融浓缩 利用酶溶液相对于纯水冰点较低的原理使酶分子与小分子物质分离。 （五）沉淀法 盐析法，有机溶剂法 * 二、酶的干燥 酶的干燥多采用冷冻干燥法。 将酶溶液在较低温度下（-10℃~-50℃）冻结成固态，然后在高度真空条件下，将其中固态水分直接升华为气态而除去，也称酶的升华干燥。 * 三、酶的结晶 结晶（Crystallization）是指物质以晶体的状态从蒸汽或溶液中析出的过程。 * 1. HPLC 原理 HPLC是利用样品中的溶质在固定相和流动相之间分配系数的不同，进行连续的无数次的交换和分配而达到分离的过程。 许多类型的柱层析都可用HPLC来代替，如离子交换层析、吸附层析、凝胶过滤等。 * 2. 分类 按溶质（样品）在两相分离过程的物理化学性质分类： 离子交换色谱（IEX-HPLC）：—— 离子交换能力 凝胶色谱（SEC-HPLC）：—— 分子大小而引起的体积排阻 分配色谱：—— 分配系数 * 分配色谱又可分为： 正相色谱：固定相为极性，流动相为非极性。 反相色谱：固定相为非极性，流动相为极性。 用的最多，约占60～70％。 固定相：硅胶填料是非极性的，官能团为烷烃。 流动相组成 ：常用“甲醇—H2O” 。 * 3. 色谱仪组成 1）进样系统 2）输液系统 3）分离系统 4）检测系统 5）数据处理系统 * Principles of Operation for Chrom