第四章rtpcr应用5和3racerace（cdna末端快速扩增，rapid.pdf

第四章  RT­PCR 应用  5  和 3 RACE  RACE （cDNA 末端快速扩增，Rapid Ampliphication of cDNA Ends）是一种获得转录本 5  或 3未知序列的方法。不象普通 RT­PCR 那样使用两个序列特异性的引物，RACE 使用一 个序列特异性的引物和或者 mRNA 的 poly(A)尾 （3 RACE）或者加到 cDNA 末端的多聚同 聚体（5  RACE）（图 11）。RACE 已经被用于扩增和克隆稀有 mRNA。RACE 的产物可以 用来克隆， 直接测序， 制备探针或连接在一起得到全长 cDNA。 其中一个连接 5  和 3 RACE  产物的方法是使用由 5  及 3 RACE 得到的序列信息设计新的引物，以扩增全长的 cDNA。 使用 RNaseH­的逆转录酶和高保真的热稳定聚合酶可以对较长的序列进行高保真的扩增， 从而得到全长 cDNA 克隆。  5 RACE 步骤概要 第一链引物，GSP1，同 mRNA 退火 使用 SuperScriptⅡ将 mRNA 转录成 cDNA  使用 RNase 混合物降解 RNA  使用 GlassMAX® Spin Cartridge 纯化 cDNA  使用 dCTP 和 TdT对纯化的 cDNA 加尾 使用简并的锚定引物和巢式 GSP2 PCR 扩增带有 dC尾的 cDNA  使用 AUAP，UAP 和巢式 GSP 重新扩增初步 PCR产物。 图 11. 5 RACE 步骤概要  5  RACE 比 RT­PCR 更具有挑战性，特异性也较低，因为只有一个引物是基因特异性的。  5  RACE  的产物可能是单一产物、多个产物，甚至是不能分辨的连续条带。结果的质量取 决于用来合成第一链和扩增的 GSP 的特异性、扩增所使用锚定引物的特异性、目的mRNA  的复杂度和丰度及产物的长度。使用巢式引物扩增 （最多可以三轮巢式扩增），并在连续几 轮扩增中使用长度选择性的扩增产物作为模板可以增加 5  RACE 的特异性（见第五章，巢 式 PCR）。增加逆转录保温温度和 PCR 退火温度，并降低扩增反应中的镁离子浓度可以促 进特异性。  5  RACE 的灵敏度受所使用的逆转录酶和 cDNA  3  末端抑制 cDNA 加尾（tailing）的二级 结构影响。cDNA 的不完全合成降低了全长产物的产量，并导致某些模板产生连续条带。因 为 SuperScriptⅡ产生更多的全长 cDNA，所以可以提高 5  末端序列检测的水平，尤其是对 于小于 1kb 的转录本。 双链 3  末端和发卡结构会通过减少用于加尾的 3  羟基而破坏 cDNA 的加尾。cDNA  的起始保温温度在 94℃并随后在冰上冷却有助于破坏二级结构。一些困难 模板可能需要加入 DMSO辅助加尾 （图12）。 加尾酶末端脱氧核苷转移酶可以耐受最多20％ 的 DMSO。 图 12. 5RACE  在 45℃使用 SuperScriptⅡ从 5μg  Hela 总 RNA 合成 cDNA。10μl 纯化的 cDNA 在 10％  DMSO 中加尾。使用人 tuberous scleosis 的引物和 ELONGASE® Enzyme Mix （初步 PCR  2.8kb；泳道 1）对 1μl 加尾反应产物直接扩增 40 个循环。在 2.8kb 条带周边移取 10μl 的 凝胶。使用 1μl 限定大小的 PCR 产物进行巢式 PCR （巢式 PCR 2.7kb；泳道 2）。凝胶使 用  SYBR® Green Ⅰ染色。巢式  PCR  后如果看不到产物或仅观察到连续条带，可以使用  Southern 印迹检测产物。这需要了解序列内部信息以制备探针。 仅扩增全长 cDNA 末端的高级 RACE 方法 为了获得全长的 cDNA 5及 3末端序列，许多研究人员使用称之为 cDNA 末端快速扩增，或  RACE  的方法。传统的  RACE 方法得到的  PCR  产物含有全长及断裂的  cDNA 产物。  GeneRacerTM 试剂盒确保只得到含有全长 cDNA 末端的完整序列， 使您得到更高效的结果 并节省时间。  GeneRacer™的优点 确定一个基因的全长序列对于研究异源转录起始和得到用于蛋白表达的开放阅读框至关重 要。GeneRacer™是一种高级 RACE 技术，提高了扩增全长 cDNA 末端序列的效率。使用  GeneRacerTM 试剂盒，可以得到  •  完整序列 克隆基因片段的全长 5和 3末端以构建完整的 cDNA