实验室诱导志贺属耐喹诺酮类抗生素靶基因突变时序检测.pdf

霉验室诱导．占赞茼属 塑丛厶堂2箜2星塑i：堂筐丝塞!地壁! 塑堕堡塑装蕴生耋壁垒!型塞尘鲢壁丝型 实验室诱导志贺菌属耐喹诺酮类抗生素 靶基因突变时序检测 硕士研究生 符幸涛 导 师 段广才教授 郑州大学公共卫生学院流行病学教研室 郑州450001 摘要 志贺菌属细菌又称痢疾杆菌，是感染性腹泻的主要病原体之一。它所引起的 细菌性痢疾是～种全球流行的急性肠道传染病，在全世界年病例数超过2亿，年 死亡人数约60万人，其中2／3是儿童。尽管世界各国在菌痢防治上付出了巨大 努力，但由于志贺菌菌型多、菌株易变迁、感染后免疫力不持久、型间无交叉免 疫等等原因，在卫生条件相对落后的发展中国家，菌痢仍难以预防；而在治疗上， 随着现代医学技术的发展，特别是近年来由于滥用抗菌药物，志贺菌频繁发生变 异产生耐药株，且耐药率高、耐药产生速度快、耐药范围广，不断给细菌性痢疾 的治疗带来新的挑战。由此，细菌性痢疾的耐药性问题已成为临床和流行病学菌 痢防治上的重要课题。喹诺酮类抗生素是目前治疗菌痢的主要药物。上世纪80 年代喹诺酮类药物应用于临床，志贺菌属细菌起初对其敏感性较高，达95％以上， 菌痢的疗效曾一度改观。但近年来已发现敏感性降至85％以下。 鉴予菌痢在肠道传染病防治工作中的重要地位及喹诺酮类药物目莳在临床 治疗感染性腹泻的重要性，研究志贺菌擒细菌的耐药性，尤其对喹诺酮类药物的 可能机制显得十分必要。喹诺酮耐药机制研究的必威体育精装版成果显示，细菌耐受喹诺酮 类药物的机制可能有以下四个方面：①靶基因突变，主要是编码DNA促旋酶A 实验室诱导志贸圈垮 整型盔堂2螋!昼受主堂丝迨室￡塑璧! 醛唑堡鲤丝笾生耋避量些I塞堡盟壁丝型 亚基的基因gyrA和编码拓扑异构酶Ⅳ的c亚基的基因parC突变；②主动外排系 统；③细菌细胞膜通透性的改变；④质粒介导的耐药。其中前三种耐药机制均为 染色体突变介导的。目前认为，靶基因突变在细菌对喹诺酮类耐药中起重要作用， 而另两种机制是细菌产生包括喹诺酮在内的多重耐药的主要机制。虽然到目前为 止，对志贺菌属细菌耐喹诺酮类药物机制的研究，包括了临床分离耐药株和体外 诱导耐药突变株，而且对各种机制的研究都有所涉及，但是对各种机制在志贺菌 属细菌耐药形成中各自的地位与相互关系尚需进一步探明。 为了解喹诺酮类各种耐药机制在志贺菌属细菌耐药形．成中各自的地位、作用 特点与相互关系，本研究以药物选择性——基因突变——耐药形成理论为出发 点，采用人工诱导的方式，用氟喹诺酮类抗生素诺氟沙星对志贺菌敏感株进行体 外诱导，使之逐步产生耐药性，通过测定诺氟沙星、四环素、氯霉素、氨苄青霉 素对各代菌株的最低抑菌浓度检测耐药程度的变化及多重耐药性的获得，并对各 增，运用PCR．SSCP对其突变性进行检测，对检测出的突变菌株进行核酸序列分 析，以明确靶基因突变位点及方向，探讨耐药程度与突变位点之间的关系，为指 导临床早期发现耐药菌株的存在，合理、有效地应用喹诺酮类抗生素，防止其耐 药性进一步增加提供依据，同时也为喹诺酮类新药品种的开发提供一定依据。并 用能量抑制剂碳酰氰间氯苯腙(Carbonylcyanide 抑制主动外排作用，观察此过程中诺氟沙星对细菌最低抑菌浓度(MIC)的变化， 探讨主动外排系统在志贺菌多重耐药中的作用及其与靶基因突变机制在志贺菌 属细菌喹诺酮耐药形成中的关系，为菌痢的防治提供理论依据和对策。 方法 1．菌株的复苏与鉴定：对我教研室4C冰箱中以半固体穿刺法保存的48株 志贺菌在LB平板上划线复苏并重新进行生化及血清学鉴定，以保证菌株的可靠 性。 2．敏感野生株的筛选：采用Kirby．Bauer纸片法进行菌株对四环素、氯霉素、 氨苄青霉素、萘啶酸、氧氟沙星、诺氟沙星、环丙沙星的药敏试验，以对以上抗 菌药物均敏感的菌株为敏感野生株(wild