第5章_基因组注释.ppt

同源性比较最常用的软件程序是BLAST，此程序能鉴别相似性大于30%-40%的同源基因 有相同的结构域的非同源基因，可以通过在已知基因中结构域的功能推测未知基因的功能 5.2.2 用实验分析阐明基因功能 通过基因失活进行功能分析 1）基因剔除（gene knock-out) 定义：通过同源重组，一段无关的DNA片段取代某一特定的基因，使其失去功能的技术 原理：在一段无关片段的两侧连接与替换基因两侧相同的顺序，将这一构件导入目的细胞，由于同源片段之间的重组，可以使无关片段取代靶基因整合到染色体中。为了便于筛选,用于取代的外源DNA中含有报告基因 * * 第一阶段 构建带有中断基因的干细胞 * * 第二阶段 将中断基因置于动物体内 2）转座子标签法（transposon tagging） 通过向基因中插入转座元件或转座子使基因失活 人工诱导转座 3）RNA干扰（RNA interference) 利用双链小RNA高效，特异地降解细胞内同源 mRNA，从而阻断靶基因表达，引起基因表达沉默 5.2.2 用实验分析阐明基因功能 基因过表达用于功能检测 通过增加基因的拷贝数和采用强启动子促使基因超表达，使受体表现出生长和发育的异常，来研究基因的功能 Activation tagging * * 5.2.2 用实验分析阐明基因功能 其他的基因功能研究方法 基因失活与过量表达是研究基因功能的基本方法，但并非只有这两种技术才能提供基因功能的信息 有许多蛋白质必须与其他蛋白质互作才能表现其功能, 常用的研究蛋白质互作的技术： 噬菌体外显(phage display)， 酵母双杂交(yeast two hybrid system) Y2H基本原理 * * UAP, universal amplification primer;AUAP,Abridged universal amplification primer,TdT,terminal deoxynucleotidyl transferase * tk 胸苷激酶标记基因 ← gangcyclovir 丙氧鸟苷，缺失此基因，对嘌呤类似物产生抗性 neor 新霉素抗性基因→对抗生素G418有抗性 第五章 基因组序列注释（genome annotation) 5.1 搜寻基因 5.2 确定单个基因功能 5.3 功能基因组学 5.1搜寻基因 5.1.1 根据基因结构特征搜寻基因 5.1.2 同源基因查询 5.1.3 实验确认基因 5.1.1 根据基因结构特征搜寻基因 通过ORF扫描（ORF scanning)定位蛋白质编码基因 “An open reading frame is a portion of a genes sequence that contains a sequence of bases, uninterrupted by stop sequences, that could potentially encode a protein” i) 原核生物中ORF扫描可有效定位基因 原核生物的ORF是指从起始密码子到终止密码子的一段序列，通常代表一个编码蛋白质的基因 start codon: ATG stop condon: TAA, TAG,TGA ORF扫描的关键是stop codon 在6种读框中出现的频率，一般长的ORF（不少于100个codon)可能代表一个基因 （Ecoli ~317codons yeast ~483 human ~450） 原核生物基因无内含子，基因间DNA少，很少有重叠基因和基因内基因，因此原核生物中简单的ORF扫描可以定位大多数基因 ii)真核生物ORF扫描程序的修改 不能仅仅根据ORF长度来判断哪种读框正确，因为： a.基因间有大量的非编码序列 b.基因通常含有非编码的内含子，外显子长度往往小于100个密码子 扫描真核生物ORF必须加入的规则： ①密码子偏倚 （codon bias) ②外显子-内含子边界（exon-intron boundaries) ③上游调控序列（upstream regulatory sequence) Codon bias:是指特定生物体的基因中并不是所有密码子的使用频率都是相同的 所有生物都有密码子偏倚，预期真正的外显子有密码子偏倚，而非编码区，三联核苷酸随机排列不会有密码偏倚现象，只有平均的碱基分布水平。所以根据已有的生物密码子偏倚的资料在编写计算机程序时会写入这些限制，许多基因注释程序会写明适用于哪些物