2012-《Geneengineering》-6-副本解读.ppt

第六章 基因工程受体与基因导入技术 掌握基因工程受体的概念和类型 掌握基因工程常用寄主特点 掌握微生物、植物、动物常用基因导入技术 第一节 基因工程受体 受体（ Host ）：能支持质粒、病毒进行复制的生物体。 受体细胞（ Host cell ）：能摄取外源DNA并使其稳定维持的细胞，是重组体扩增的场所。 受体细胞的选择是重组基因高效克隆或表达的基本前提之一。 有接受外源DNA分子的能力。（易接纳外源DNA，易转化） 能使重组DNA分子稳定存在于细胞中。（如限制性酶缺陷型） 便于重组体的筛选。（选用与载体选择性标记相匹配的受体细胞基因型，如phenotype: his-, leu-,trp-,ura-） 遗传稳定性高，易于培养或发酵。（营养、耗氧、速度、成本） 安全性高，无致病性，不会对外界环境造成生物污染。（如进行缺陷必需因子的改造） 选用内源蛋白水解酶基因缺失或蛋白酶含量低的细胞，有利于表达蛋白的胞内积累或胞外分泌表达。（毕赤或酿酒酵母） 受体细胞在遗传密码应用上无明显偏倚性。 具有较好的转译后加工机制，便于真核基因的表达。 三、基因工程受体类型 原核细胞受体系统 真核细胞受体系统 （一）原核细胞受体系统 大部分原核生物细胞没有细胞壁，便于外源基因进入； 染色体DNA无固定结合蛋白，避免了与外源DNA的重组； 基因组简单，不含线粒体和质体基因组，便于对外源基因进行遗传分析； 大多为单细胞生物，易获得一致性的实验材料； 培养简单、繁殖迅速、研究周期短等。 不具备真核生物的蛋白质折叠复性系统； 缺乏真核生物的蛋白质加工系统； 内源性蛋白酶的存在导致表达产物不稳定。 遗传背景清楚——利于研究 繁殖快——易于获得大量基因产物 含有质粒——利于基因转移 表达非E.coli 基因——潜力极大 表达水平高——tp 5-30% 下游技术成熟——分离纯化 高水平表达的产物易沉淀、凝聚，不易折叠，无生物活性； 胞内表达形成的无活性包涵体，需复性； 产物纯化工艺复杂，细胞壁含脂多糖（内毒素），增加分离纯化难度； 安全性不高，产物易受内外毒素、荚膜、黏附素等毒物污染，损伤人体健康； 产物对受体菌有毒害作用； 产物易被水解 缺乏产物表达后加工机制 常用菌株 X11-Blue：四环素抗性和奈啶酮酸抗性，用于分子克隆和质粒提取。 BL21(DE3)：用于蛋白质表达。 BL21(DE3)ply：含降低背景表达的T7溶菌酶基因，用于蛋白质表达。 DH5α：其基因表达产物可与载体的β-半乳糖苷酶实现α互补，用于蓝白斑筛选；用于分子克隆、质粒提取和蛋白质表达。 TOP10：高效DNA克隆和质粒扩增。 JM109：分子克隆、质粒提取和蛋白质表达。 …… 2. 枯草芽孢杆菌受体系统 最大优点——外分泌； 高水平表达，产物不发生沉淀； 产物纯化相对简单； 产物污染少，安全； 产物不易被水解；遗传背景仅次于E.coli。 3. 乳酸杆菌受体系统 食品级微生物，安全； 自身分泌蛋白少，干扰性小； 不产生胞外蛋白酶，分泌蛋白不发生降解。 用作疫苗载体时，免疫方便、便宜、不需注射、无免疫原性，并且，在呼吸系统、消化系统、泌尿系统定植对维持微生态平衡很重要。 （二）真核细胞受体系统 不含病毒，不产生毒素，安全性大； 遗传信息和生理状况适于真核基因表达； 结构最简单的真核生物之一，遗传背景清楚，遗传操作较简单； 产物可胞内、胞外表达； 具有基因表达后加工机制； 培养条件普通，生长繁殖迅速，生产工艺简单，可规模生产，成本低廉。 2. 动物受体系统（动物体、动物细胞） 特点： 表达外源基因具有后加工系统，能够指导蛋白质的正确折叠，提供复杂的糖基化翻译后加工功能，因而表达产物在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接近于天然的高等生物蛋白质分子，即基因产物具有活性。 缺陷： 提高细胞密度是其重要限制 因子 。较难大规模培养，培养速度慢，培养条件要求高，成本高。 动物受体细胞条件： 细胞系特征：丧失细胞接触抑制和锚地依赖特征，便于大规模培养； 遗传稳定性：外源基因多次传代后不至于丢失，易于长期保存； 合适的标记：便于转化株的筛选和维持； 生长快且齐：分裂周期短、生长均匀、便于控制； 安全性能好：不合成分泌致病物质、不致癌。 来源 常用细胞株： 中国仓鼠卵巢细胞（CHO） 小仓鼠肾细胞（BHK） 猴肾细胞（COS ） 小鼠胸腺瘤细胞（NSO ） 小鼠骨髓瘤细胞（SP2/0 ） 人胚胎肾细胞（HEK-239） 基因瞬时表达： COS 、 BHK、 HEK-239 基因稳定表达： CHO 中国仓鼠卵巢（CHO）细胞 ——已应用于医疗用品的大规模生产 遗传背景清