2014免疫细胞化学解读.ppt

* * 如:１.异硫氰酸荧光素( FITC) ex:490nm, es:520-530 绿色 ２.四乙基罗达明 ex:570nm, es:595nm 明亮的橙色 ３.四甲基异硫氰酸罗达明 ex:550nm, es:620nm 橙红色 ４.藻红蛋白(PE) 多种，橙黄-红色 荧光素 海马细胞 微管蛋白 绿色(胞体、树突) 轴突终末蛋白 红色(突触) 黄色？ 共定位 原代培养的小鼠心肌细胞 检测细胞连接及细胞黏附 (黏附相关蛋白质-FITC） 补充: 荧光标记蛋白质技术: 近年大量用于表达重组蛋白的培养细胞，作为外源性蛋白质表达的标记，可用于考察 亚细胞定位 subcellular localization 多分子共定位 co-localization subcellular localization 带标签的重组蛋白 Recombinant protein RFP-tag GFP-tag co-localization Protein1. Protein2. mRFP-H2B GFP-B23 GFP-SENP3 RFP-B23 By Yang Kai, unpublished data 1.双重或多重标记，同时比较不同分子的位置及量的关系。 2.双重或多重标记，同时染色细胞器和感兴趣分子，可显示分子的亚细胞定位信息。 3.根据荧光素的强度，进行半定量分析 免疫荧光技术优点： DAPI 蛋白1 shRNA-蛋白B 载体与EGFP融合 merge 是将酶作为标记物使组织细胞中形成的抗原抗体复合物得到标记，再通过酶细胞化学反应产生显微镜下可见的显色物质，间接显示抗原物质的定位. 普通光学显微镜即可观察 （二） 免疫酶技术 酶 抗原 一抗 二抗 酶标二抗 酶—抗酶抗体复合物 抗酶抗体 酶标抗体法 抗酶抗体法 复合物法 酶标记的三种形式：信号的放大 一抗 二抗 抗酶抗体 一抗 二抗 抗酶抗体复合物 一抗 二抗 常用的标记酶： 辣根过氧化物酶 2.碱性磷酸酶 外源的酶，与细胞内的内源酶应该有明显区别. 显示辣根过氧化物酶（HRP) 底物为DAB(二氨基联苯胺)，经一系列氧化聚合反应后形成聚合物， 在光镜下呈棕黄色; DAB经锇酸固定后能生成具有锇黑,电镜下呈现高电子密度. 既适用于光镜，又适用于电镜。 HRP H2O2 H2O nDAB 锇酸 锇黑（高电子密度） DAB 氧化聚合物 (棕黄色) a.底物：萘酚衍生物， 捕捉底物：固红或固蓝 产物：红或蓝色偶氮色素 AP 底物 红或蓝偶氮色素 固红或固蓝 AP BCIP 蓝紫色色素 NBT b.底物：吲哚酚酯， 捕捉底物：四唑盐， 产物：蓝紫色 显示碱性磷酸酶(AP) （1）过氧化物酶标记抗体法 （2）过氧化物酶-抗过氧化物酶复合物法 （Peroxidase-Antiperoxidase,PAP） *一抗 +组织抗原 *二抗 +第一抗体 +PAP复合物 *加入 H2 O2 和DAB 光镜-棕黄色反应产物(组织抗原的定位) １.辣根过氧化物酶 （hoseradish peroxidase, HRP） 一抗 二抗 PAP “桥梁” JMJD2B在结肠癌中的表达 HRP标记抗体 正常组织 肿瘤组织 灵敏度：高 特异性：好 2.阳性程度有差异 ++： % +： % -： % 结果判断 3.核质分布有差异 核+： % 质+： % 1.正常/肿瘤有差异 Fu L, et al. Carcinogenesis,2012,33(9):16