汗腺三维重构模型中EGFR作用.docVIP

汗腺三维重构模型中EGFR的作用 外泌汗腺的主要功能是泌汗，排汗是人类调节体温的重要方式。严重大面积深度烧（创）伤愈合后，由于大部分汗腺毁损，机体散热调节体温能力下降，在盛夏季节，患者多感闷热、瘙痒等全身不适，严重影响了患者的身心健康与生活质量[1]。为了解决汗腺的修复与再生，学者们从不同的途径对汗腺的发育、修复与再生进行了研究，也取得了一定的进展[2, 3]。我们先前对骨髓间充质干细胞（MSCs）转分化为汗腺细胞的研究显示，MSCs在一定条件下可以转分化汗腺，转分化来的汗腺细胞表达泌汗相关功能蛋白，并且能够促进汗腺功能的修复。但MSCs在体内的低转分化率（约0.5~1‰）与MSCs促进汗腺功能恢复的结果并不十分吻合，我们进一步研究发现，大鼠足垫汗腺组织BrdU标记滞留细胞明显高于表皮基底层的BrdU标记滞留细胞，这一公认的表皮干细胞位点[4]。我们推测除了转分化作用，MSCs的旁分泌效应——促进汗腺内源干细胞激活在MSCs促进汗腺功能恢复中起着重要作用[5]。既然汗腺细胞具有丰富的干细胞来源，利用汗腺自身的细胞促进汗腺的修复与再生可能会是更直接、有效的途径。 既往对汗腺损伤修复和再生的体外研究，多建立在单层组织细胞培养技术（2D）基础上，单层培养的组织细胞，能够快速分裂增殖，但细胞在体外改变的环境下增生，逐渐丧失了原有的性状，同时调控细胞增殖、代谢、分化和死亡的重要信号丧失，而这些信号负责形成组织特异性结构和功能，因此，在很多情况下，单层细胞组织培养技术所得到的研究结果和体内的情况并不符合[6-8]。在生命科学和医学科学研究领域，我们更关注的是体外培养的组织细胞能否模拟体内组织细胞的性状。三维培养模式（3D）组织具体形态发生Bissell利用细胞外基质（ECM）——matrigel成功地构建了乳腺癌上皮细胞的组织培养模型，利用乳腺癌的三维模型，他们在乳腺癌的形成、作用机制和药物治疗方面取得了重大进展[7-10]。参照Bissell的方法并对其进行改进，我们构建了汗腺细胞的三维培养模型，我们的研究显示：体内/外情况下，汗腺细胞在细胞外基质中可以形成具有腔的单层或复层管状结构；有基底膜形成；表达汗腺的系列标志抗原、泌汗相关的功能蛋白，与细胞功能密切相关的细胞连接蛋白，表明在细胞外基质中重构的汗腺三维结构类似于在体汗腺的结构和功能[11] (图1)。该模型对于进一步研究汗腺重建的分子机制具有重要的作用。 图1重构汗腺与在体汗腺的对比研究 受体酪氨酸激酶是最大的一类由细胞外结构域、单次跨膜的疏水α螺旋区、含有酪氨酸蛋白激酶活性的细胞内结构域三部分组成受体酪氨酸激酶, EGFR基因表达较弱，随着胎龄的增长，特别在皮肤汗腺诱导形成阶段，EGFR基因表达量增加最明显；在胎儿皮肤及附属器发育完成后，表达量增加缓慢[14, 15]。②成熟汗腺的导管部腔细胞膜和胞浆有无活性的EGFR；分泌部细胞和导管部细胞的细胞核有活化的EGFR表达[16, 17]。③先天性外胚层发育不良综合征（一组外胚层发育缺损的先天性疾患，累及皮肤及其附属EGFR mRNA和有免疫活性的EGFR蛋白减少[18]。④通过同源重组灭活EGFR导致小鼠在孕期或出生时死亡，或者仅能存活8~20天。出生后存活的小鼠存在上皮性器官，如皮肤、肺和胃肠道的发育受损。⑤EGFR敲除小鼠模型显示，从胚胎植入到出生后的发育存在广泛的发育缺陷，表明EGFR信号通路参与各种发育事件[19]。⑥鸟类和哺乳类耳蜗的再生性增生需要EGFR信号通路，EGFR信号通路通过下调细胞周期抑制剂p27(Kip1)使细胞重新进入细胞周期[20]。⑦EGFR的过表达，与汗腺肿瘤及其它上皮性肿瘤密切相关[21, 22]。本项目的预实验显示：重构的汗腺三维结构表达EGFR；当在汗腺培养基中加入EGFR特异性酪氨酸激酶抑制剂——AG1478，浓度大于0.5μmol/L，汗腺细胞在细胞外基质中不能形成三维结构，呈单个散在细胞，表明EGFR在汗腺三维结构的形成中起着重要作用。综上所述，我们提出以下假说：EGFR是细胞外基质诱导汗腺细胞重构汗腺三维 图2 本假说可能的机制：EGFR激活的通路：①通过经典的受体-配体途径；我们前期去除汗腺细胞培养基中的EGF，对汗腺3D的形成并无影响，表明外源性EGF并不是EGFR激活所必须的；但不排除汗腺细胞有自分泌EGF的能力，通过自分泌方式激活EGFR。②非经典的受体-配体途径（integrin依赖途径）激活，细胞粘附到细胞外基质（ECM）主要由integrin介导，是连接细胞外基质和细胞的主要的细胞，我们前期研究在汗腺培养基中加入integrin功能阻断剂，汗腺同样不能形成3D结构，表明Integrin有可能通过某种方式激活EGFR。激活的EGFR，激活下游信号通路，引起基因转录，细胞增殖