狂犬病病毒检测历史及研究分析进展.docVIP

狂犬病病毒检测历史及研究进展 卢彦欣1 王雷1 扈荣良2 （1.吉林大学畜牧兽医学院，长春，130062 2.军事医学科学院军事兽医研究所 130062） 狂犬病(Rabies)是由狂犬病病毒(Rabies virus)感染温血动物和人的中枢神经系统后引发急性致死性脑脊髓炎的一种人兽共患传染病。狂犬病是迄今为止人类病死率最高的急性传染病之一，100 %。狂犬病主要分布在亚洲、非洲和拉丁美洲等发展中国家[1 ，2 ] 2000多年前，我国就有狂犬病的记载[3] ，目前，我国是世界上受狂犬病危害最为严重的国家之一。 人类对狂犬病的认识曾经经历了漫长的历史过程，对其本质的认识也只是在近一百年内才完成的。随着上世纪初期和中叶微生物尤其是病毒实验技术的不断发展，人类对狂犬病本质的认识逐渐深入。在狂犬病认识史中具有里程碑意义的工作，是十九世纪八十年代法国科学家路易斯巴斯德（Louis Pasteur）及其同事发现狂犬病是由一种传染因子引起的，并且证明这种传染因子不但存在于唾液中，而且出现在整个神经系统，它的真正感染部位是在中枢神经部位。巴斯德及其同事于1885年利用传代获得的固定病毒成功制备成了疫苗。1903年，Negri发现了嗜伊红包涵体，但当时他错误地认为引起狂犬病的病原是一种原虫，并最后将狂犬病命名为“神经细胞恐水病”。尽管如此，数年后，这种Negri小体（嗜伊红包涵体）作为狂犬病的一种重要的诊断特征盛行起来。 1926年超速离心技术、1930年电子显微镜技术的引入以及1928年超滤技术的出现进一步促进了人类对病毒及其本质的认识。二十世纪六十和七十年代，狂犬病病毒的形态、化学组成、抗原特性和细胞培养等才有了一个清晰的轮廓。 狂犬病病毒属弹状病毒科(Rhabdoviridaes)狂犬病毒属(Lyssavirus)，有包膜，其基因组为单股负链RNA，编码N、P、M、G及L 5种结构蛋白。几乎所有的温血动物都对狂犬病病毒易感，犬是本病毒的敏感宿主和贮存宿主之一，在狂犬病的传播过程中起主要作用。狂犬病主要通过动物咬伤后，ouse Inoculation Test, MIT) 此方法最初用于狂犬病的诊断是在1935年[5]。依照WHO狂犬病专家委员会推荐[6]，FAT检测为阴性的结果必须再次经动物试验证实。 狂犬病病毒具有较强的嗜神经性，可采用小鼠颅内接种法分离病毒后，再进行狂犬病特异性抗原的检测。试验用小鼠一般选择体重10g左右的健康小鼠，性别、品种不限。3日龄以内的乳鼠，可提高病毒分离的阳性率。可疑动物脑组织或唾液腺组织可用于病毒的分离，从流行病学角度考虑，检查唾液腺中的病毒更为重要，但脑组织的病毒检出率要更高。脑组织需要预先用含1%~5%灭活牛血清的生理盐水或PBS或脱脂奶研磨成10%悬液，离心5min去除粗颗粒；唾液腺需切碎后再研磨，1~2层无菌纱布过滤后，颅内接种小鼠，0.03ml/只，随时观察接种小鼠的表现和体征。小鼠颅内接种狂犬病病毒后潜伏期至少5d，在此期间出现的死亡为非特异性死亡，原因可能是接种材料污染细菌、接种时损伤小鼠脑组织等。之后逐日记录小鼠正常、发病、死亡的数量及其病症，其典型症状为竖毛，镊子夹其尾部倒提时出现震颤，置于平面时后腿运动失调、麻痹、直至死亡[7]。同时应用FAT法检测所有死亡或发病小鼠脑组织中的狂犬病病毒。 MIT法的特点：敏感，准确性较高；试验要求不高，适于不具备组织培养条件的实验室分离狂犬病病毒街毒；周期长，仅凭动物发病症状不足以确诊，常常配合免疫荧光法作特异性鉴定。 3.2 细胞培养分离技术(Cell-culture Isolation Techniques, CIT) 20世纪70年代中期以来，各实验室相继用地鼠肾传代细胞(BHK-21)、鸡胚细胞、鼠神经瘤细胞(MNa)和其他传代或原代细胞系分离狂犬病病毒街毒。与小鼠颅内接种法相比所需时间大大缩短。有研究表明，小鼠MNa细胞分离街毒的敏感性并不低于MIT法[8.9]，如果接种物中含有少量的街毒，颅内接种小鼠，仅有50%的分离率，而用CIT检出达99%[10]，但BHK-21细胞分离街毒的敏感性较MNa细胞低。10%脑悬液样品离心去除大组织块后接种MNa细胞，培养18小时或更长时间（4天）后，冷丙酮固定细胞，用荧光标记的抗狂犬病病毒核蛋白抗体染色，荧光阳性者表明检测样品中含有狂犬病病毒。 该方法的特点：敏感，周期短，需配合免疫荧光进行特异性诊断；成本低；需在具备组织培养条件的实验室中进行；适合样本量较大时的检测；样品严重污染细菌或腐败致使样品中病毒失活，会导致分离病毒失败。 4. 病毒蛋白检测 4.1 荧光抗体实验(Fluorescent Antibody Test ,FAT) 狂犬病病毒感染的细胞内有由狂犬病病毒核衣壳聚集形成的包