突变冬虫夏草菌丝体中多糖提取,纯化及抗肿瘤活性研究分析.docVIP

突变的冬虫夏草菌丝体中多糖的提取，纯化及抗肿瘤活性研究 摘要 从突变的冬虫夏草中可大量提取出一种水溶性多糖（命名为MCMP），通过热水提取，利用sevage法、乙醇沉淀，阴离子交换和凝胶过滤层析CL-6B法脱除蛋白质。该多糖由甘露糖、鼠李糖、半乳糖和葡萄糖组成，它们的摩尔比为59.36:1:8.31:39.50，其平均分子量为8100。在这项研究中，我们选择喉癌Hep-G2细胞，Hela细胞和肾小球系膜细胞来研究该多糖的抗肿瘤活性。MTT测定结果表明，经48小时的培养后，该突变体菌株的多糖对细胞增殖有抑制作用。 引言 冬虫夏草，最昂贵的中国传统药物之一，被认为是中国罕见的虫草。冬虫夏草具有广泛的药理活性，包括抗炎，镇痛抗氧化，抗血栓生成，常用于补肾、缓解肺部炎症，治疗高血糖，高血脂，肾功能不全和肝脏疾病等。现代医学研究表明，冬虫夏草对人体的几个系统有益，如循环系统、免疫、造血、心血管、呼吸和腺体系统。 然而，时下，冬虫夏草的过度开发导致了野生冬虫夏草的灭绝及土地的荒漠化。培育虫草，而不是传统的恢复冬虫夏草是人们迫切需要的。在中国及东南亚，一般将培育子实体作为原料药和保健食品进行售卖。近年来，科学家们对它的生命周期进行了广泛研究，以期分离出发酵菌株。 从天然冬虫夏草中已分离出几株。木耳栽培技术已被用于培育冬虫夏草，它们显示出类似的药理活性，冬虫夏草可以生产多种生物活性成分如虫草素，D-甘露醇和某些多糖。 多糖因其多种多样的生物活性而备受关注，它被广泛地应用在化妆品，药品，食品营养等行业。 研究发现，某些多糖对包膜病毒有抵抗功效，包括HSV-1病毒，流感病毒和人巨噬细胞病毒，而且具有抗肿瘤活性。 冬虫夏草具有多种类型的多糖，已报道它们具有许多令人关注的生物活性，包括免疫刺激，抗肿瘤活性和自由基清除等。中国吉林大学普通生物学中心实验室研究发现，突变冬虫夏草（H4019）高产多糖达0.780 g / L。因此，本研究的目的是对冬虫夏草H4019的多糖进行分离，纯化，表征及抗肿瘤潜能的探究。 2.材料和方法 2.1 药品 琼脂糖凝胶CL-6B是从Pharmacia Biotech公司购得。 DEAE-52纤维素阴离子交换柱是来自Amersham Biosciences公司。三氟乙酸（TFA）购自Merck公司。 3 - （4,5 - 二甲基-2 - 基）-2,5 - 二苯基溴化（MTT），刀豆蛋白A（刀豆）和脂多糖（LPS）购自Sigma化学公司。 作为介质的RPMI-1640培养基购自GIBCO Invitrogen公司。 RMPI-1640培养基，用于免疫学实验，配有HEPES缓冲液10μmol/ml，青霉素100 IU/mL，链霉素100 g/ml，L-谷氨酰胺2mol/ml，2 - 巯基乙醇50mol/L,10％的新生牛血清，pH=7.2。 所有其他试剂均为可用的最高品质。 2.2 细菌培养 将原始菌株（CGMCC5.699）在马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）斜面上，26℃下培育7天，然后在液体培养基中激活4天诱导出高产突变冬虫夏草（H4019）。种子菌液与浸没液以4％的比例接种到发酵液中，得到真菌菌丝。真菌菌丝体冷冻干燥并收集。用蒽酮-硫酸法以葡萄糖为标准确定总碳水化合物含量。 2.3 MCMP的提取 从冬虫夏草中获得的真菌菌丝体，在沸水浴中加热3.5小时，并用4层纱布过滤。将固体物质在相同条件下萃取两次。合并滤液并离心除去不溶于水的物质。离心（8000r/min，10min）后，将上清液浓缩至1000mL，加入95％（体积分数）乙醇。乙醇最终体积分数为80％。悬浮液在3000r/min下离心10min后，收集沉淀物，并将其冷冻干燥，得到粗多糖级分。碳水化合物总含量测定。将多糖重新溶解在1000ml蒸馏水中，用Sevag法(试剂V正丁醇：V氯仿=1:4，250ml)处理，将其在5000 r/min下离心15 min以除去蛋白质。The supernatant was dialyzed against deionized water over night before concentration in a vacuum evaporator at 55 °C. 将上清液透析去离子水中过夜，用真空蒸发器在55℃下进行浓缩。将乙醇与样品以4:1（体积比）进行沉淀，并除去沉淀和溶剂乙醇后，得到冬虫夏草（MCMP）的菌丝体脱蛋白的多糖级分。总碳水化合物的含量确定了。 2.4 MCMP的纯化 将20mgMCMP溶解在1ml的蒸馏水中，用DEAE-52纤维素阴离子交换柱（2.6厘米×60公分）进行离子交换。该柱先用去离子水，然后再用梯度溶液（0.1，0.2和0.3mol/L的NaCl）分别以0.5ml/min的流速进行洗脱。收集级分