10食工基因工程的基本技术2要点.ppt

（1）、基于载体遗传标记检测 ? 抗药性筛选法； ? 显色筛选法。 ? 营养缺陷型筛选法； 根据载体遗传标记特点，可细分为： ROP ROI Sal I BamH I Tc r Pvu I Pst I Pst I EcoR I Cla I Hind III Hind II Bal I Ap r pBR322 4363 bp ori ? 抗药性筛选法： 抗药类型： 氨苄青霉素 卡那霉素 四环素 氯霉素 链霉素 ?显色筛选法： ?限制性酶切图谱法； ?菌落（噬菌斑）原位杂交法； ? DNA序列分析法。 ? PCR扩增法 （2）根据克隆DNA序列检测 ROP ROI Sal I BamH I Tc r Pvu I Pst I Pst I EcoR I Cla I Hind III Hind II Bal I Ap r pBR322 4363 bp ori ? 限制性酶切图谱法 ? DNA序列分析法。 Sanger 双脱氧法 （3）基于插入外源基因表达产物检测： ?免疫化学检测法： ?聚丙烯酰胺凝胶电泳法。 包括抗体测定法（如ELISA法）、免疫沉淀法 前提条件：克隆基因在宿主细胞内表达 在琼脂培养基中加入目标蛋白的特异性抗体，目的重组子菌落会分泌出目标蛋白，后者与特异性抗体发生免疫沉淀反应，在菌落周围形成白色的圆斑。 ?免疫化学检测－－免疫沉淀鉴定： ?免疫化学检测－－ELISA法 ? 聚丙烯酰胺凝胶电泳法。 技术5 核酸杂交技术 (Nucleic acid hybridization) 互补的核苷酸序列通过Waltson-Crick碱基配对形成稳定的杂合双链DNA分子、DNA-RNA分子的过程称为杂交 。 一、核酸分子杂交的定义 二、核酸杂交类型 Southern杂交： Northern杂交： Western杂交： 菌落原位杂交： 主要类型： DNA RNA 蛋白质 DNA 探针 DNA DNA 抗体 DNA 被检测对象 其它： 原位杂交 ：FISH、GISH 斑点(dot)杂交和狭槽(slot)杂交。 三、杂交三要素 1、探针（DNA、RNA或抗体） 包括探针的来源和标记 2、被检测的对象（DNA、RNA或蛋白质） 包括被检测样品的分离准备 3、杂交膜 -- 硝酸纤维素滤膜、尼龙膜和Whatman 541滤纸 1、探针 §1、探针的分类 ?按核酸分子的不同：可分为DNA探针和RNA探针 ?根据标记物的不同：可分放射性标记探针和非放射性标记探针； §2、探针的标记方法 ?双链DNA探针标记主要方法：  A、切口平移法 B、随机引物合成法 DNA聚合酶Ⅰ：合成DNA链作用 A、切口平移法 A G ? DNA酶Ⅰ 打开缺口作用 DNA聚合酶Ⅰ 涉及的相关酶： DNA酶Ⅰ：打缺口作用 B、随机引物合成法 §原理：是使寡核苷酸引物与DNA模板结合, 在 Klenow酶的作用下,合成DNA探针。 四、Southern杂交 1、Southern杂交操作步骤: (1) 用限制性内切酶酶切DNA, 经凝胶电泳分离各酶切片段； (2) 转膜：将DNA片段转移到硝酸纤维素滤膜或尼龙膜上； 转膜方式：毛细管转移法、真空印迹法、电转移法 。 (6) 自显影检查目的DNA所在的位置。 (3) 预杂交：封阻滤膜上非特异性位点； (4) 杂交：让探针与同源DNA片段特异性结合； (5) 洗脱：去除非特异性结合的探针； 2、 Southern杂交影响因子分析 1）、目的DNA在总DNA中所占的比例 3）、转移到滤膜上的DNA量 2）、探针的大小和标记效率 4）、探针与靶DNA的同源性 3、Southern杂交的目的与用途 §目的：用来检测被研究DNA中（包括经限制性内切酶切割后的DNA片段或PCR产物）是否存在与探针同源的DNA序列。 ?基因定位 ?转基因的真实性、转基因的拷贝数、克隆基因的正确性等方面的检测鉴定。 §用途： 四、Northern杂交 过程基本同Southern杂交，但有两处不同： 一是检测的对象是RNA； 二是凝胶电泳用变性琼脂糖凝胶，打开二 级结构。 五、Western杂交 杂交对象是蛋白质，通过PAGE胶电泳，再将蛋白质转移到固相支持物上，通过抗体与蛋白质特异性反应进行检测。 技术6 基因文库构建 ?基因文库构建的目的: ?基因文库类型： ?基因组文库（含有全部基因）； ? cDNA文库（各种编码蛋白基因的集合） 从文库中筛选出目的基因或用于生物基因组测序 ?什么是基因组文库？ 是一个特定生物体所有基因的集合，以各基因重组子