酶联免疫吸附.ppt

ELISA的类型 一）双抗体夹心法测抗原 利用待测抗原上的两个抗原决定簇A和B分别与 固相载体上的抗体A和酶标记抗体B结合，形成 抗体A-待测抗原-酶标抗体B复合物，复合物的 形成量与待测抗原含量成正比，属于非竞争性 反应。 抗体 固相抗体 保温 受检标本 抗原 洗涤 酶标抗体 抗体 酶标 洗涤 加底物 保温 洗涤 此法适用于测定二价或二价以上的大分子抗原， 不适用于测定半抗原及小分子单价抗原，因其不能 形成两位点夹心。 双抗体夹心法测抗原的另一注意点是类风湿因子 （RF）的干扰。采用F（ab‘）或Fab片段作酶结合物 的试剂，由于去除了Fc段，从而消除RF的干扰。 抗体的选择：如抗体的来源为抗血清，包被和 酶标用的抗体最好分别取自不同种属的动物。 二）间接法测抗体 原理为将已知抗原连接在固相载体上，待测抗体与抗原结合后再与酶标二抗结合，形成抗原-待测抗体-酶标二抗的复合物，复合物的量与待测抗体量成正比，也属于非竞争性反应。 抗原 固相抗原 洗涤 受检血清 抗体 洗涤 酶标抗抗体 抗抗体 酶标 洗涤 加底物 保温 保温 主要用于对病原体抗体的检测而进行传染病的诊断 间接法中另一种干扰因素为正常血清中所含的高浓 度的非特异性IgG ，非特异IgG可直接吸附到固相 载体上，有时也可吸附到包被抗原的表面。 在间接法中，抗原包被后一般用无关蛋白质（BSA） 再包被一次，以封闭（blocking）固相上的空余间 隙。在检测过程中标本须先行稀释（1:40～ 1:200），以避免过高的阴性本底影响结果的判断。 三）竞争法 可用于检测抗原和抗体。用酶标抗原（抗体）与待测 的非标记抗原（抗体）竞争性的与固相载体上的限量 抗体（抗原）结合，待测抗原（抗体）多，则形成非 标记复合物多，酶标复合物就少，故显色程度与待测 物含量成反比。 小分子激素、药物等ELISA测定多用此法。 对照孔与样品孔底物降解量的差＝未知抗原量 四）捕获包被法测抗体 在临床检验中测定抗体IgM时多采用捕获包被法。 抗人IgM固相抗体的形成 加入血清标本，形成抗人IgM固相抗体-特异性IgM抗 体复合物 加入抗原，形成抗人IgM固相抗体-特异性IgM抗 体-抗原复合物。 加酶标记针对抗原的特异性抗体，形成抗人IgM固相 抗体-特异性IgM抗体-抗原-酶标抗体复合物。 酶再与底物作用，呈色即与标本中的IgM成正相关。 此法常用于病毒性感染的早期诊断。 * 酶免疫技术 EIA 拟探讨的问题 ELISA的原理 ELISA的试剂（三个必要试剂） ELISA的类型 ELISA的过程 ELISA的操作要点 酶免疫技术的定义 酶免疫技术的类型 酶免疫技术的发展 概念 以酶标记的抗体（抗原）作为主要试剂，将抗原抗体反应的特异性和酶催化底物反应的高效性和专一性结合起来的一种免疫检测技术。 常用的酶及显色底物 常用酶 底物 加终止液前颜色 加终止液后颜色 辣根过氧化物酶（HRP） 邻苯二胺（OPD） 橙黄色 橙黄色 ? 四甲基联苯胺（TMB） 蓝色 黄色 碱性磷酸酶（AP） 对硝基苯磷酸酯（p-NPP） 黄色 黄色 酶免疫技术类型（按抗原抗体系统的定位划分） 酶免疫技术 酶免疫组化 酶免疫测定 均相酶免疫测定（EMIT、CEDIA） 异相酶免疫测定 液相酶免疫测定 固相酶免疫测定（如ELISA） 均相酶免疫测定 利用酶标记物结合抗原抗体复合物后，标记酶的活性就受到抑制，因而反应后不需分离结合的和游离的酶标记物，直接测定系统中的总标记酶的活性的变化，即可确定结合的酶标记物的数量，从而得到待测物的含量。常用于半抗原如药物、激素、毒品、兴奋剂等的测定。 酶免疫增强测定技术（EMIT） 酶活性的抑制是由于标记抗原与抗体结合后空间位阻了酶与底物结合的部位而造成的。反应模式竞争法，当未标记抗原和标记抗原与限量的抗体竞争结合时，未标记抗原多，竞争性的与抗体结合多，则标记抗原与抗体结合少，酶的活性受到抑制少，酶活性高。最终测的酶活性与未标记的抗原含量呈正相关。 抗体 酶 抗体 酶 半抗原（未标记） 底物 标记抗原 酶 克隆酶供体免疫分析（CEDIA） 酶是以供体和受体两个片段存在的，只有两个片段结 合在一起形成全酶才具有活性，当标记了供体酶的抗 原与抗体结合后就空间位阻了酶供体（ED）与酶受体 （EA）的结合，从而不能形成有活性的全酶，酶活性 受到抑制。反应模式为竞争性结合。最终测的酶活性 与未标记抗原的含量呈正相关。 ED + 标本中抗原 ED标记抗原 抗体 ED + EA X EA ED 活性酶 异相酶免疫测定 抗原抗体反应平衡后，体系中同时存在游离的和结合的酶标记物，两种标记物上的酶都具活性，而只有结合的酶标记