酶联免疫吸附双抗体夹心法资料.ppt

酶联免疫吸附双抗体夹心法 测定血清中甲胎蛋白含量 临床八年1205班2组 陈旭 陈楷 李皓 一、实验目的 二、实验原理 基础知识 1971年瑞典学者Engvail和Perlmann,荷兰学者Van Weerman和Schuurs分别报道将免疫技术发展为检测体液中微量物质的固相免疫测定方法，即酶联免疫吸附测定法 enzyme-linked immunosorbent assay , ELISA 。ELISA现在已成为目前分析化学领域中的前沿课题 ，它是一种特殊的试剂分析方法，是在免疫酶技术 immunoenzymatic techniques 的基础上发展起来的一种新型的免疫测定技术。 甲胎蛋白（α fetoprotein，AFP） 一种含4%碳水化合物的单链糖蛋白，分子量70KD，半衰期 5天，由592 个氨基酸残基的单肽链组成。基因位于第4对染色体4q1124q21区域，由 15 个外显子和14个内含子组成，属于血清中一种α球蛋白，是一种胚胎性相关蛋白。自1963年发现以来，作为一种肿瘤特异性抗原已广泛应用于临床。它对原发性肝癌的早期诊断具有重要意义，同时对肝细胞癌的鉴别诊断，流行病学调查和理论研究都很有价值。 原理一 ELISA的基础是抗原（或抗体）的固相化及抗原（或抗体）的酶标记。结合在固相载体表面的抗原（或抗体）仍保持其免疫学活性。 原理二 抗原 或抗体 可通过共价键与酶连接形成酶结合物，而此种酶结合物仍能保持其免疫学和酶学活性。 原理三 固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结果，使测定方法达到很高的敏感度。 双抗体夹心法 方法 用已知抗体包被，加入待测抗原，再加酶标抗体，加底物显色。 固相 包被 抗体Ab + 样品 抗原Ag + 酶标抗体Ab * → Ab-Ag-Ab* + 底物 TMB →显色 应用 这种方法欲测的抗原必须有两个可以与抗体结合的部位，因为其一端要与包被于固相载体上的抗体作用，而另一端则要与酶标记特异性抗体作用。 双抗体夹心法图示 三、实验仪器试剂 试剂 待测血清、抗-AFP-L3 抗体、封闭蛋白溶液、辣根过氧化物酶（HRP）、底物四甲基联苯胺（TMB 、显色液、终止液…… OR: 甲胎蛋白（AFP）定量测定试剂盒（酶联免疫法） 四、实验步骤 详细步骤 辣根过氧化物酶 HRP 五、结果分析 六、思考题 试验中哪些因素可能会对实验结果造成影响？ 六、应用 Your company slogan LOGO 1 掌握酶联免疫吸附实验（ELISA）的原理 2 熟悉酶联免疫吸附实验的操作方法 ELISA的三条基本原理 双抗体夹心法测抗原 + - E E E E E E E E E 仪器 全自动酶标仪、全自动酶标洗板机 获得AFP未标定抗体 将AFP抗体与固相 载体连接形成固相抗体 洗涤除去未结合的 抗体及杂质 加入封闭蛋白溶液以封闭载体 表面残留的蛋白结合位点 洗涤并除去未结合的封闭蛋白 加血清形成 固相抗体－抗原复合物 洗涤除去其他 未结合的物质 加HRP酶标抗体生成 抗体—待测抗原—酶标记抗体 的复合物 彻底洗涤未结合 的HRP酶标抗体 加底物四甲基联苯胺 TMB 进行酶催化反应 根据颜色反应的程度 进行AFP的定量测定 1. 标准品的稀释与加样：在酶标包被板上设标准品孔10 孔，在第一、第二孔中分别加标准品100μl，然后在第一、第二孔中加标准品稀释液50μl，混匀；然后从第一孔、第二孔中各取100μl 分别加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分别加标准品稀释液50μl，混匀；然后在第三孔和第四孔中先各取50μl 弃掉，再各取50μl 分别加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分别加标准品稀释液50ul，混匀；混匀后从第五、第六中各取50μl 分别加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分别加标准品稀释液50μ，混匀后从第七、第八孔中分别取50μl 加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分别加标准品稀释液50μl，混匀后从第九第十孔中各取50μl 弃掉。（稀释后各孔加样量都为50μl，浓度分别为（1800ng/L ，1200ng/L，600ng/L，300ng/L， 150ng/L）。 2. 加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品最终稀释度为5 倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。 3. 温育：用封板膜封板后置3