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【易误警示】 (1)DNA母链的3′端对应着子链的5′端,即DNA的两条链是反向平行的。 (2)解旋酶的作用是使DNA两条链的氢键断开,而DNA聚合酶与DNA连接酶都是催化形成磷酸二酯键的。 (3)DNA聚合酶是将单个核苷酸加到已有的单链片段的3′端上,需要模板,而DNA连接酶连接的是两条DNA片段的缺口,不需要模板。 知能过关演练 本部分内容讲解结束 点此进入课件目录 按ESC键退出全屏播放 谢谢使用 优化方案系列丛书 专题5 DNA和蛋白质技术 基础自主梳理 核心要点突破 知能过关演练 课题2 多聚酶链式反应扩增DNA片段 课标领航 1.尝试PCR(DNA多聚酶链式反应)技术的基本操作。 2.理解PCR的原理和反应过程。 3.讨论PCR的应用。 【重点】 PCR的原理和反应过程。 【难点】 PCR技术的操作过程。 情境导引 PCR诊断技术又叫多聚酶,链式反应技术,它采用分子技术,模拟核酸在体内的复制,从而判,定疾病病原体的种类,所以从本,质上来说,这是一种分子诊断方法。 核心要点突破 知能过关演练 课题2 多聚酶链式反应扩增DNA片段 基础自主梳理 基础自主梳理 一、PCR扩增的原理及条件 1.概念:PCR即_______________,是一种体外迅速扩增DNA片段的技术。它能以极少量的_____为模板,在短时间内复制出上百万份的DNA拷贝。 2.原理 (1)DNA的热变性:在80~100 ℃的温度范围内,DNA_________结构解体,双链分开,这个过程称为_____。当温度缓慢降低后,两条彼此分离的DNA链又会重新结合成双链。 多聚酶链式反应 DNA 双螺旋 变性 (2)子链的合成:①需要______;②合成方向总是从子链的5′端向3′端延伸。 3.条件 (1)______模板。 (2)分别与模板DNA两条链相结合的两种引物。 (3)A、T、G、C四种______________。 (4)耐热的DNA聚合酶,一般用Taq DNA聚合酶。 (5)需要稳定的_____和能严格控制_____的温控设备. 引物 DNA 脱氧核苷酸 pH 温度 思考感悟? 1.什么是引物?若要克隆DNA,应加入几种特定的引物? 【提示】 所谓引物是指两段与待扩增的DNA序列互补的一小段DNA或RNA片段。DNA是由两条反向平行排列的脱氧核苷酸长链构成的。在DNA扩增时,DNA聚合酶不能从头开始合成DNA,只能从引物的3′端延伸DNA链,因此克隆DNA时应加入两种引物。 二、PCR反应过程 PCR一般要经历三十多次循环,每次循环可以分为____、复性和延伸三步。 1.变性:当温度上升到______以上时,双链DNA解聚为单链。 2.复性:温度下降到_______左右,两种引物通过________________与两条单链DNA结合。 3.延伸:温度上升到_____左右,溶液中的四种脱氧核苷酸在_______________的作用下,根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。 变性 90 ℃ 50 ℃ 碱基互补配对 72 ℃ DNA聚合酶 思考感悟? 2.PCR循环过程中,变性温度设置95 ℃,时间设置30 s的原因是什么? 【提示】 变性温度过低,解链不完全导致DNA不能扩增。变性温度过高影响酶的活性;在此温度条件下如果处理时间过长,将会导致酶的钝化。 三、实验操作 1.实验用具 (1)PCR仪:该仪器能自动调控_____,实现DNA的扩增。如果没有PCR仪,可用3个___________代替,操作时按程序在3个水浴锅中来回转移PCR反应的微量离心管。 (2)微量离心管:总容积为0.5 mL,实际上是进行离心的场所。 (3)微量移液器:用于吸取转移PCR配方中的液体,其上的一次性吸液枪头每吸取一种试剂后都要更换。 温度 恒温水浴锅 2.操作步骤 准备→____→混合→_____→反应。 四、操作提示 1.为避免外源DNA等因素的污染,实验中使用的一些用具在使用前必须进行__________。 2.所用的_________和酶应分装成小份,并在-20 ℃储存。 五、DNA含量的测定 1.原理:利用DNA在260 nm的紫外线波段的______曲线来测定相应含量。 2.计算公式:DNA含量(μg)=50×(260 nm的读数)×_____________。 移液 离心 高压灭菌 缓冲液 吸收 稀释倍数 核心要点突破 PCR原理 1.PCR扩增方向:为了明确地表示DNA的方向,通常将DNA的羟基(—OH)末端称为3′端,而磷酸基团的末端称为5′端。DNA聚合酶不能从头开始合成DNA,而只能从3′端延伸DNA链,即DNA的合成方向总是从子链的5′端向3′端延伸。 2.PCR原理——DNA的热变性原理 通过控制温度来控制双链的解聚与结合
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