多聚酶链式反应极好解析：.pptVIP

课题2多聚酶链式反应扩增DNA片断 * * 1．概念：PCR即_______________，是一种体外迅速扩增DNA片段的技术。它能以极少量的_____为模板，在短时间内复制出上百万份的DNA拷贝。 多聚酶链式反应 DNA 遗传疾病的诊断、 刑侦破案、 古生物学、 基因克隆 DNA序列测定。 2 、PCR技术 的应用 一、基础知识 （一）回忆DNA的复制 回答相关问题 1、发生时间： 发生在细胞有丝分裂的间期和减数第一次分裂间期。 2、特点(方式)： 边解旋边复制 半保留复制 多起点复制 3、合成条件 模板： 原料： 游离的脱氧核苷酸 DNA两条链 能量： ATP 酶: 解旋酶、DNA聚合酶 反应条件温和 4、场所： 细胞核(主)、线粒体、叶绿体 DNA母链：提供复制的模板 解旋酶：打开DNA双链 4种脱氧核苷酸：合成子链的原料 DNA聚合酶：催化合成DNA子链 ATP：为复制过程提供能量 引物：使DNA聚合酶从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸 （二）DNA复制的条件 1 2 3 4 5 脱氧核苷酸结构 1．DNA的平面结构： O O P O HO 碱基 O OH O O P O HO OH 碱基 碱基 脱氧核糖 磷酸基团 碱基 脱氧核糖 碱基 脱氧核糖 5’ 3’ 磷酸二酯键 DNA3’端，5’端指什么。 DNA的羟基(-OH)末端称为3’端，而磷酸基团的末端称为5’端。 脱氧核苷酸 链 结构 目录 上页 下页 习题 参考书 返回 A T G C A T G C 5，端含磷酸基团 3，端含羟基 3，端 5，端 目录 上页 下页 习题 参考书 返回 DNA聚合酶的特性 --- 专一性 DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，而只能从3’端延伸DNA链。因此，DNA复制需要引物。 观察图 2复制的方向： 2 方向：子链的5’端向 3’端延伸。 （1）、 DNA 分子的热变性原理 DNA双链 单链 变性（加热80-100℃） 复性（缓慢冷却） 变性的目的： 解开双链:解开氢键 在80~100 ℃的温度范围内，DNA的双螺旋结构将解体，双链分开，这个过程称为 2、PCR原理 变性 高温解决了打开双链的问题，但是，又导致DNA聚合酶失活的问题，耐高温的Taq DNA聚合酶解决了高温导致DNA聚合酶失活的问题，促成了PCR技术的自动化。 （2）、Taq DNA聚合酶的应用 （3）、PCR 反应的条件 ①DNA模板； ②分别与两条模板链相结合的两种引物（引物Ⅰ和引物Ⅱ）； ③四种脱氧核苷酸； ④耐高温的聚合酶（Taq DNA聚合酶）； ⑤控制温度，但不需解旋酶； ⑥需要在一定的缓冲液中进行。 PCR 反应需要的这些条件的原因是什么？ 1 2 3 4 5 22 55 72 94 时间（min） 温度 （℃） 适温延伸 高温变性 低温复性 重复1~3步30轮 （1）、步骤：变性 ——复性——延伸 二、PCR的反应过程 5/ 3/ 3/ 5/ 5/ 3/ 引物Ⅰ 5/ 3/ 引物Ⅱ 变性95oC 复性55oC 延伸72oC 5/ 3/ 3/ 5/ 5? 引物1 5? 引物2 第二次复制 第一次复制 5? 5? 5? 5? 5? 5? 模板DNA 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 25～30 次循环（复制）后，模板DNA的含量可以扩大100万（220）倍以上。 2、PCR的反应结果 ①从第二轮循环开始，上一次循环的产物也作为模板参与反应，并且由引物Ⅰ延伸而成的DNA单链会与引物Ⅱ结合，进行DNA的延伸 ② DNA聚合酶只能特异性地复制处于两个引物之间的DNA序列，使这段固定长度的序列呈指数扩增。 三、 PCR反应的实验操作 1、PCR仪 设备及用具 2、微量离心管 一种薄壁塑料管，总容积为0.5ml 3、微量移液器 用于定量转移PCR配方中的液体，其上的一次性吸液枪头用一次更换一次 实质上一台能够自动调控温度的仪器 三、 PCR反应的实验操作 （1）按配方将所需试剂摆放在实验桌上（准备） （2）用微量移液器按配方在微量离心管中依次加入各组分（移液） （3）盖严离心管口的盖子，用手指轻轻弹击管壁（混合） （4）将微量离心管放在离心机上（离心） （5）将离心管放入PCR仪上，设置好PCR仪的循环程序（反应） 循环数 变性 复性 延伸 第一次 94°C,10min － － 30次 ９4℃，30s 55℃，30s 72℃，1min 最后一次 ９4℃，1min 55℃，30s 72℃，1min *