多聚酶链式反应扩增DNA片段(上课)解析：.pptVIP

实验注意事项 1避免外源DNA污染：所用仪器、缓冲液、蒸馏水等使用前高压灭菌。 2缓冲液和酶分装成小份，－20℃低温保存。 3每添加一种反应成分，更换一个移液器的枪头。 4混匀后离心处理，使反应液集中在离心管底部。 参与的组分 在DNA复制中的作用 解旋酶 DNA母链 4种脱氧核苷酸 DNA聚合酶 引物 细胞内DNA复制的基本体系 打开DNA双链 提供DNA复制的模板 合成子链的原料 催化合成DNA子链 使DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸 一、PCR（多聚酶链式反应） 1．概念：PCR即_______________，是一种体外迅速扩增DNA片段的技术。它能以极少量的_____为模板，在短时间内复制出上百万份的DNA拷贝。 2．原理 1)DNA的热变性：在80～100 ℃的温度范围内，DNA_________结构解体，双链分开，这个过程称为_____。当温度缓慢降低后，两条彼此分离的DNA链又会重新结合成双链。 2)子链的合成：①需要______；②合成方向总是从子链的5′端向3′端延伸。 多聚酶链式反应 DNA 双螺旋 变性 引物 3、PCR反应过程 PCR一般要经历三十多次循环，每次循环可以分为____、复性和延伸三步。 （1）变性：当温度上升到______以上时，双链DNA解聚为单链。 （2）复性：温度下降到_______左右，两种引物通过________________与两条单链DNA结合。 （3）延伸：温度上升到_____左右，溶液中的四种脱氧核苷酸在_______________的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。 变性 90 ℃ 50 ℃ 碱基互补配对 72 ℃ DNA聚合酶 1 2 3 4 5 22 55 72 94 时间（min） 温度 （℃） 适温延伸 高温变性 低温复性 重复1～3步30轮 DNA复制的方向： DNA的合成方向总是从子链的5’端向3’端延伸 变性 →复性（退火） → 延伸 PCR的反应过程 5/ 3/ 3/ 5/ 5/ 3/ 引物Ⅰ 5/ 3/ 引物Ⅱ 变性95oC 复性55oC 延伸72oC 5/ 3/ 3/ 5/ 5? 引物1 5? 引物2 第二次复制 第一次复制 5? 5? 5? 5? 5? 5? 模板DNA 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 25～30 次循环（复制）后，模板DNA的含量可以扩大100万（220）倍以上。 三、 PCR实验操作 1、PCR仪 （一）设备及用具 2、微量离心管 一种薄壁塑料管，总容积为0.5mL 3、微量移液器 用于定量转移PCR配方中的液体，其上的一次性吸液枪头用一次更换一次 实质上是能够自动调控温度的仪器 PCR扩增仪 PCR扩增仪实际上就是一台能够自动调控温度的仪器，它可以根据DNA的热变性原理，通过自动改变温度，达到扩增DNA片段的目的。 4、离心机 一种通过高速转动产生离心现象，能将固体与液体分开的设备。 （1）按配方将所需试剂摆放在实验桌上（准备） （2）用微量移液器按配方在微量离心管中依次加入各组分（移液） （3）盖严离心管口的盖子，用手指轻轻弹击管壁（混合） （4）将微量离心管放在离心机上（离心） （5）将离心管放入PCR仪上，设置好PCR仪的循环程序（反应） 循环数 变性 复性 延伸 第一次 94℃，5min － － 30次 94℃，30s 55℃，30s 72℃，1min 最后一次 ９4℃，1min 55℃，30s 72℃，1min （二）操作步骤： 四、 结果分析与评价 DNA 含量的测定：稀释 → 对照调零 → 测定 → 计算 50倍 蒸馏水做对照 波长260nm处读数 （一）理论上DNA扩增数目的计算 1 、一条DNA，复制n次， DNA为2 n 2 、 a条DNA，复制n次， DNA为a x2 n （二）实验中DNA含量的测定 1 、原理 可以通过测量DNA含量来评价扩增的效果，DNA在260nm的紫外线波段有一强烈的吸收峰，峰值的大小与DNA的含量有关 光吸收 波长／nm 260 240 220 280 0.1 0.2 2 、过程 ①稀释 2μL PCR反应液，加入98μL蒸馏水，即将样品进行50倍稀释 ②对照调零 以蒸馏水作为空白对照，在波长260nm处，将紫外分光光度计的读数调节至零 取DNA稀释液100μL至比色杯中，测定260nm处的光吸收值 ③测定并计算 DNA含量（?g/mL）＝50×(260nm的读数)×稀释倍数 体内DNA复制与PCR的技术区别： 体内复制 PCR技术 解旋 在解旋酶作用下，细胞提供ATP，部分解开 加热到94oC,双链全部解开，不需解旋酶 引物 一小段RNA 一般用DNA片段 DNA聚合酶 细胞自身的DNA