【医学课件】分子筛层析.ppt

医学下载吧 * 缺点：分辨率不高，分离操作较慢。由于凝胶层析是以物质分子量的不同作为分离依据的，分子量的差异仅表现在流速的差异上，所以分离时流速必须严格把握。因而分离操作一般较慢。而且对于分子量相差不多的物质难以达到很好的分离。此外，凝胶层析要求样品粘度不宜太高。凝胶颗粒有时还有非特异吸附现象 。 医学下载吧 * 医学下载吧 * 凝胶的预处理 医学下载吧 * 【目的】 掌握凝胶层析的基本原理 学习利用凝胶层析法分离纯化物质的实验技能 凝胶层析（分子筛层析） * 层析也称之色谱，基本原理是分析样品作为流动相流过固定相时，由于样品中的各个成分与固相相互作用不同使得样品中的各个成分通过固定相的速率产生了差别，从而达到分离样品中各个成分的目的。 层析因固相介质不同又分为离子交换层析、分子筛层析和吸附层析等各种层析。 5.2 层析原理 【原理】 * * 层析也称之色谱，基本原理是分析样品作为流动相流过固定相时，由于样品中的各个成分与固相相互作用不同使得样品中的各个成分通过固定相的速率产生了差别，从而达到分离样品中各个成分的目的。 层析因固相介质不同又分为离子交换层析、分子筛层析和吸附层析等各种层析。 5.2 层析原理 【原理】 * 【原理】 凝胶层析也称分子筛层析、排阻层析。是利用具有网状结构凝胶的分子筛作用，根据被分离物质的分子大小不同来进行分离的技术。 经常使用的凝胶有交联葡聚糖（Sephadex）、聚丙稀酰胺凝胶和琼脂糖（Sepharose）。 * 单个凝胶珠本身象“筛子”。不同类型凝胶的筛孔的大小不同。 凝胶过滤层析 凝胶珠 * 带网孔的凝胶珠 小分子不同程度自由进入凝胶珠内 大分子不能进入珠内，经珠之间缝隙流出 凝胶过滤层析过程示意图 * 总结： 直径大于凝胶网孔的分子(相对分子量大） 被完全排阻 流程较短，阻力小，速度快；首先流出。 直径小于凝胶网孔的分子（相对分子质量小） 可完全渗透进入网孔， 流程较长，阻力大，移动速率慢；最后流出。 中等大小的分子， 凝胶颗粒内外部分渗透， 渗透程度取决于它们分子的大小，流出介于二者之间。 各组分按分子从大到小的顺序依次流出，从而达到了分离的目的。凝胶的网孔大小决定了凝胶的分级分离范围（fractionation range)。 * 几个有关凝胶体积的术语： Vt：凝胶柱床的总体积（total volume),常称为柱床体积。 Vo: 孔隙体积（void volume)或外体积。 Vi:内体积（inner volume),凝胶珠内部的水相体积。 Vm:凝胶基质体积(matrix volume) * Ve:某一溶质组分的洗脱体积（elution volume),是自加样品开始到该组分洗脱峰（峰顶）出现时的流出体积。 Ve=Vo+Kd×Vi Kd: 与凝胶孔隙、溶质分子大小相关的函数， 0 ≤Kd ≤ 1 * 凝胶层析的应用范围： 凝胶层析法适用于分离和提纯蛋白质、酶、多肽、激素、多糖、核酸类等物质。 凝胶层析的优点： 凝胶层析具有设备简单、操作方便、分离迅速、效果好、重复性高、不影响分子的生物学活性等。 * 【试剂与器材】 1.待分离样品：0.5%蓝色葡聚糖(Blue DeXtran 2000，蓝色，分子量为2×l06)和0.5%铬酸钾(黄色，分子量为194.2)混合物。 2.葡聚糖凝胶G-25 (Sephadex-G-25) 3.洗脱液：蒸馏水； 4.层析柱、铁架台:两人一组； 5.细玻棒及滴管(细长)。 6.试管及试管架、烧杯。 * 【操作方法】 胶干粉经蒸馏水室温充分溶胀48h，抽真空脱去颗粒空隙中的空气； 将胶悬液搅匀，每组倒取50mL。 凝胶的预处理 装 柱 柱垂直放好，关闭出水口; 关闭出口，加入洗脱液约3cm高： 自顶部缓缓加入稀薄的搅匀胶悬液，待底部凝胶沉积1-2cm，再打开出水口(10滴/min) ，继续加入上述悬液; 至凝胶层沉积达15cm即可，关闭出水口。 平整 连续、均匀 无气泡 无“纹路” * 用2～3倍柱床体积的洗脱液平衡，流速为0.5mL/min。（略） 静置2 min后打开出水口，使溶液缓缓流下，至液面刚好或即将进入凝胶柱表面，关闭出水口； 取葡聚糖（14滴）和重铬酸钾（7滴）混合； 旋转、沿壁，缓缓加入： 开启出水口，使样品流入柱内； 关闭出水口。小心加入蒸馏水 20滴，开启出水口，使缓缓流入柱内（7滴/min)。 平 衡 加 样 不要搅动凝胶面，应保持平整： 液面不能低于凝胶面