第五章PCR技术解析.ppt

DNA的变性(denaturation)： 在某些理化因素作用下，DNA分子内碱基对之间的氢键断裂，使规则有序的双螺旋结构变为不规则无序的单链线团样结构的过程。 解链温度（融解温度，Tm）(melting temperature)： 使50%的DNA发生变性时的环境温度。 DNA的变性从开始解链到完全解链是在一个相当窄的温度内完成的。 DNA的复性（renaturation)： 在适当条件下，变性DNA的两条互补链可再恢复成天然的双螺旋结构的过程。 影响复性的因素 ① 序列简单的分子复性快，如poly(dT)和poly(dA)识别快 ② DNA片段愈大，扩散速度愈低，复性慢 ③ 离子强度↑→有利于复性 ④ DNA浓度↑→复性↑ （二）反应成分——五要素 引物 （primer） 酶 （Taq DNA polymerase） dNTP （dATP,dGTP,dCTP,dTTP） 模板 （template） Mg2+ （magnesium） buffer（其他） 1. 引物 引物是PCR特异性反应的关键 PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度 引物设计的原则 ①引物长度：15-30个碱基，常为20个碱基左右 ②引物扩增跨度：以500 bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段 ③引物碱基：G+C含量以40-60%为宜, ATGC最好随机分布 ④避免引物内或引物间出现二级结构 避免两引物间互补，特别是 3`端 ⑤引物 3`端的碱基要求严格配对 特别是最末及倒数第二个碱基 ⑥引物中可以加上合适的酶切位点 要作酶切时加 ⑦引物的特异性 引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性 ⑧两引物的Tm值接近（向差5℃左右） 2. 酶及其浓度 Taq DNA聚合酶 注：无3`→ 5`方向的校正活性 [DNA复制1/109；PCR 出错率1/(2×104)] 一个典型的 PCR 反应约需酶量 2.5 U 浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少 3. dNTP 的质量与浓度 dNTP使用注意： 1)保存：使用时应配成高浓度，小量分装，-20℃冰冻保存。多次冻融会使dNTP降解； 2)使用量：在PCR反应中，dNTP应为20-200umol/L; 3)成分配比：注意4种dNTP的浓度要相等. 4. 模板（template） 模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败的关键环节之一。 5. Mg2+浓度 1)Mg2+对扩增特异性和产量有显著影响: Mg2+浓度过高，反应特异性降低；浓度过低会降低 Taq DNA聚合酶活性，使反应产物减少。 2)在一般的PCR反应中，各种dNTP浓度为200μmol/L时，Mg2+浓度为1.5～2.0 mmol/L为宜； （三）反应特点 1. 特异性强 靶序列的特异性决定扩增产物的特异性。 在较高的温度下进行，引物结合的特异性大大增加。 2. 灵敏度高 PCR 产物的生成量是以指数方式增加 从 100 万个细胞中检出一个靶细胞 在细菌学中最小检出率为3个细菌 3. 简便、快速 在DNA扩增仪中进行变性-退火-延伸反应，一般1～3 小时完成。 4. 对模板的纯度要求低 可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等粗制的DNA或RNA扩增检测。 （四）常见问题与对策 PCR常见问题之一 无扩增产物 PCR常见问题之二 PCR常见问题之三 PCR常见问题之四 1) 操作时防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外； 2) 除不能耐高温的物质外，所有试剂器材均高压消毒。离心管及枪头等一次性使用。 3) 各种试剂先进行分装，低温贮存。 1. 污染原因 (1) 模板间交叉污染 (2) PCR试剂污染 (3) 实验室中克隆质粒的污染 2. 防止污染的方法 (1) 合理分隔实验室 (2) 移液枪不能接触PCR相关试剂 (3) 手套、吸头、小离心管一次性使用 (4) 设阳性和阴性对照，重复实验 移液枪是什么时候谁发明的？ 微量加样器（移液器）最早出现于1956年，由德国生理化学研究所的科学家Schnitger发明，其后，在1958年德国Eppendorf公司开始生产按钮式微量加样器，成为世界上第一家生产微量加样器的公司。这些微量加样器的吸液范围在1—1000~1之间，适用于临床常规化学实验室使用。微量加样器发展到今天，不但加样更为精确，而且品种也更加多种多样。 移液枪的工作原理是什么？ 常用的是空气垫加样器活塞冲程(空气垫)加样器可很方便地用于固定或可调体积液体的加样，加样体积的范围在小于1ul至l0ml之间。加样器中的空气垫的作用是将吸于塑料吸头内的液体样本与加样器内的活