蛋白质分离纯化鉴定资料.ppt

2011-protein-science-2 色谱（层析） 色谱过程 混合物在固定相和流动相中分配原理不同 色谱分离机理 ——离子交换色谱 色谱分离机理 ——排阻色谱 色谱分离机理 ——亲和色谱 分子筛 固定相——与待分离物质具有特定关系的物质 产生差速迁移的基础 物质亲和力的差异 缺点 必须找到合适的配体；价格 优点 专一性强因而层析产物纯度高 色谱洗脱方式 等度洗脱 线形梯度洗脱 分步洗脱 自始至终用一种洗脱液 洗脱液可以是几种充分，以一定规律改变其浓度，或pH，或离子强度等 不同洗脱液更换 柱色谱中使用的检测方法 UV280 生物活性 检测器 UV 荧光 电化学 电导 平面色谱中使用的检测方法 显色试剂 荧光 紫外 Protein purification by chromatography 色谱图 洗脱曲线 HPLC简单介绍 泵 色谱柱 （多种类型） 检测器 （多种类型） 数据采集 进 样 器 柱温箱 LC—MS 色质联用仪 质谱仪 多维液相色谱分离 蛋白质组学 色谱技术与蛋白质组学研究 双向凝胶电泳 非凝胶技术 局限性 （1）低丰度蛋白和膜蛋白的检测 （2）碱性蛋白质的分离与检测 （3）分子量大小的限制 （4）重复性问题 （5）有限的动态范围 （6）自动化问题 一维和多维的非凝胶技术 高效、快速、自动化程度高、灵敏度高 检测限(100kDa、10 kDa) 二维色谱分离蛋白质有多种组合模式 离子交换色谱/凝胶过滤色谱∽反相色谱 二维凝胶电泳 多维色谱-MS 凝胶图像分析 酶解 酶解 样品（组织、细胞等） 二维数据库 数据库检索 蛋白质鉴定 肽混合物 肽阶梯序列 肽指纹谱 肽序列标签 MS 沉淀技术 离心技术 电泳技术 色谱技术 浓缩技术 盐、有机溶剂 离心技术 离子交换、过滤、亲和 柱、平面、仪器 聚丙烯酰胺凝胶电泳 免疫电泳, 蛋白印迹,毛细管电泳 透析、超滤，冰冻干燥, 沉淀技术、离心技术 电泳技术 原理 用途 除了电荷作用，同时具有分子筛作用 SDS polyacrylamide-gel electrophoresis (SDS) 消除了原携带电荷的差别，迁移仅与分子量有关 Electrophoresis Can Determine Mass. The electrophoretic mobility of many proteins in SDS-polyacrylamide gels is inversely proportional to the logarithm of their mass. The gel is stained with Coomassie blue. The positions of some of the major proteins in the gel are indicated in the drawing. SDS polyacrylamide-gel electrophoresis pattern of the proteins in the human red blood cell membrane. 1-4 Two-dimensional gel electrophoresis, a technique for separating proteins based on their charge and their mass. 蛋白质组学 免疫电泳 分离与鉴定一次完成 Western blotting Isolation and Identification 蛋白印迹技术 沉淀技术 离心技术 电泳技术 色谱技术 浓缩技术 盐、有机溶剂 离心技术 聚丙烯酰胺凝胶电泳 免疫电泳, 蛋白印迹,毛细管电泳 离子交换、过滤、亲和 透析, 超滤, 冰冻干燥, 沉淀技术、离心技术 柱、平面、仪器 透析、超滤，冰冻干燥, 沉淀技术、离心技术 用途：脱去盐、小分子、水 冰浴或 置入冰箱 透析、超滤，冰冻干燥, 沉淀技术、离心技术 用途：进一步分离、样品浓缩 超滤离心过滤管 一次性超滤管 超 滤 器 透析、超滤，冰冻干燥, 沉淀技术、离心技术 通过升华从冻结的生物产品中去掉水份或其他溶剂的过程。冰冻干燥的过程中样品的结构不被破坏，固体成份被坚冰支持,冰升华时，在干燥的剩余物质里留下孔隙，保留了物质的生物和化学结构及其活性的完整性。 检 测 技 术 依赖于被分离物的特性 酶活性 生物活性 免疫学检测 蛋白质定量 专一 通用 放 射 性 物 质 蛋白质定量 紫外分光光度法 福林－酚法（Lowry