蛋白质化学生物化学资料.ppt

* 亮氨酸侧链：2-甲基丙基 异亮氨酸侧链：1-甲基丙基 * 吲哚甲基，吲哚基团形成乙醛酸反应，紫色环。 * 甲硫氨酸侧链：2-甲硫基乙基 * 吡咯环或吡咯烷基 * * 对羟苯甲基即酚基，米伦反应，白色沉淀。 * 乙酰胺、丙酰胺 * 巯基，2个半胱氨酸的巯基可形成二硫键。 * * 羧甲基、羧乙基 * 4-氨丁基、 3-胍基丙基（坂口反应、红色）、咪唑（与重氮苯磺酸反应，生成棕红色）甲基 * * * * * * * * ③有机溶剂分级分离法 A.作用机理： a.降低水溶液的介电常数，使溶质溶解度降低； b.破坏大分子周围水膜，使溶解度降低。 利用不同蛋白质在不同浓度的有机溶剂中的溶解度不同而使蛋白质分离的方法，称为有机溶剂沉淀法。经常使用的有机溶剂是乙醇和丙酮。 B.优点： 比盐析法析出的沉淀容易过滤或离心分离，分辨力比盐析法好，溶剂也容易除去。 * C.缺点： 有机溶剂沉淀法易使蛋白质和酶变性，所以操作必须在低温条件下进行。 有机溶剂沉淀法一般与等电点沉淀法联合使用。即操作时溶液的pH值应控制在欲分离蛋白质的等电点附近。 注意： （1) 低温操作。 （2）使用低浓度有机溶剂。 （3）样品稳定结构范围内，选择溶解度最低处的pH，即与等电点共沉淀结合使用。 * 3) 根据电荷不同的纯化方法 ①电泳 带电颗粒在电场中泳动的速度称迁移率或泳动度。 泳动度与带电颗粒所带净电荷的数量，颗粒大小和形状有关。一般说，净电荷数量愈多，颗粒愈小，愈接近球形，泳动度愈大。 聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE) 聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(acrylamide，简称Acr)和交联剂N，N-甲叉双丙烯酰胺(methylene-bisacrylamide,简称Bis)在加速剂和催化剂的作用下聚合并联成三维网状结构的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis，简称PAGE)。凝胶的聚合常用过硫酸铵(AP)为催化剂，四甲基乙二胺(TEMED)为加速剂。 此外，核黄素亦可为催化剂，聚合需光照，故使用不多。 * * 聚丙烯酰胺凝胶有下列优点： (1)在一定浓度时，凝胶透明，有弹性，机械性能好。 (2)化学性能稳定，与被分离物不发生化学反应。 (3)对pH和温度变化较稳定。 (4)几乎无电渗作用，样品分离重复性好。 (5)样品不易扩散，且用量少，其灵敏度可达10-6g。 (6)凝胶孔径可通过选择单体及交联剂的浓度调节。 (7)分辨率高，尤其在不连续凝胶电泳中，集浓缩、分子筛和电荷效应为一体，有更高的分辨率。 PAGE应用范围广，可用于蛋白质、酶、核酸等生物分子的分离、定性、定量及少量的制备， 还可测定相对分子质量、等电点等。 * ②离子交换层析 离子交换剂是由基质、电荷基团(或功能基团)和反离子构成的，基质与电荷基团以共价键连接，电荷基团与反离子以离子键结合。 离子交换剂与水溶液中离子或离子化合物的反应主要以离子交换方式进行，假设以RA+代表阳离子交换剂，其中A+为反离子，A+能够与溶液中的阳离子B+发生可逆的交换反应，反应式为： RA++B+ RB++A+ * 4)利用对配体的特异生物学亲和力的纯化方法 亲和层析是利用生物分子间所具有的专一而又可逆的亲和力而使生物分子分离纯化的层析技术。 具有专一而又可逆的亲和力的生物分子是成对互配的。主要的有：酶和底物、酶与竞争性抑制剂、酶和辅酶、抗原与抗体、DNA和RNA、激素和其受体、DNA与结合蛋白等。 在成对互配的生物分子中，可把任何一方作为固定相，而对样品溶液中的另一方分子进行亲和层析，达到分离纯化目的。例如，酶与其辅酶是成对互配的，既可把辅酶作为固定相，使样品中的酶分离纯化，也可把酶作为固定相，使样品中的辅酶分离纯化。 * 2.6.3 蛋白质一级结构测定 基本策略：片段重叠法＋氨基酸顺序直测法。 要点如下： ?测定蛋白质的分子量及其氨基酸组分 ?测定肽键的N－末端和C－末端 ?裂解多肽链 应用两种或两种以上的水解法断裂蛋白质多肽链，可用肽键内切酶分别在多肽键的专一位点上断裂肽键；也可用溴化氰法专一性地断裂甲硫氨酸位点，从而得到一系列大小不等的肽段。 ?分离提纯所产生的肽段，并分别测定它们的氨基酸顺序 ?将这些肽段的顺序进行跨切口重叠，进行比较分析，推断出蛋白质分子的全部氨基酸序列。 * 将肽段顺序进行叠联以确定完整的顺序 将肽段分离并测出顺序 专一