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人(Human)白介素4(IL4)定量检测试剂盒(ELISA)两步法
本试剂盒只能用于科学研究,不得用于医学诊断
人(Human)白介素4(IL-4)ELISA
检测试剂盒
使用说明书
检测原理
试剂盒采用双蛋白两步夹心法酶联免疫吸附试验(ELISA)。往预包被捕获蛋白的透明微孔中,依次加入标准品、标本,温育并洗涤后,再加入HRP标记的检测蛋白,温育并洗涤后,用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色,并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的待测蛋白浓度呈正相关。用酶标仪在450nm 波长下测定吸光度(OD 值),计算样品浓度。
样品收集、处理及保存方法
1. 血清:使用不含热原和内毒素的试管,操作过程中避免任何细胞刺激,收集血液后,3000转离心10分钟将血清和红细胞迅速小心地分离。
2. 血浆:EDTA、柠檬酸盐或肝素抗凝。3000转离心30分钟取上清。
3. 细胞上清液:3000转离心10分钟去除颗粒和聚合物。
4. 组织匀浆:将组织加入适量生理盐水捣碎。3000转离心10分钟取上清。
5. 保存:如果样本收集后不及时检测,请按一次用量分装,冻存于-20℃,避免反复冻融,在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻。
自备物品
酶标仪(450nm)
高精度加样器及枪头:0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL
37℃恒温箱
操作注意事项
试剂盒保存在2-8℃,使用前室温平衡20分钟。从冰箱取出的浓缩洗涤液会有结晶,这属于正常现象,水浴加热使结晶完全溶解后再使用。
标准品临使用时再稀释,稀释后用剩的标准品应立刻丢弃,不可保存。
实验中不用的板条应立即放回自封袋中,密封(低温干燥)保存。
严格按照说明书中标明的时间、加液量及顺序进行温育操作。
所有液体组分使用前充分摇匀。
试剂盒组成
名称 96孔配置 48孔配置 备注 微孔酶标板 12孔×8条 12孔×4条 无 标准品 0.6mL 0.6mL 按说明书进行稀释 样本稀释液 6mL 3mL 无 标准品稀释液 6mL 3mL 无 检测蛋白-HRP 6mL 3mL 无 20×洗涤缓冲液 25mL 15mL 按说明书进行稀释 底物A 6mL 3mL 无 底物B 6mL 3mL 无 终止液 6mL 3mL 无 封板膜 2张 2张 无 说明书 1份 1份 无 自封袋 1个 1个 无 试剂的准备
标准品:标准品(1600pg/mL)在实验前用标准品稀释液进行倍比稀释,得到6个浓度点(包括标准品点):1600、800、400、200、100、50pg/mL
2. 20×洗涤缓冲液的稀释:蒸馏水按1:20稀释。
洗板方法
手工洗板:甩尽孔内液体,每孔加满洗涤液,静置1min后甩尽孔内液体,在吸水纸上拍干,如此洗板4-5次。
自动洗板机:每孔注入洗液350μL,浸泡1min,洗板4-5次。
操作步骤
从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条,剩余板条密封放回4℃。
除空白孔外,标准品孔各加不同浓度的标准品50μL;待测样本孔中先加入待测样本10μL,再加样本稀释液40μL(即样本稀释5倍),用封板膜封住反应孔,37℃水浴锅或恒温箱温育30min。
弃去液体,吸水纸上拍干,每孔加满洗涤液,静置1min,甩去洗涤液,吸水纸上拍干,如此重复洗板5次(也可用洗板机按说明书操作洗板)。
除空白孔外,每孔加入检测蛋白-HRP 50μL,用封板膜封住反应孔,37℃水浴锅或恒温箱温育30min。
重复步骤3的操作。
每孔加入底物A、B各50μL,轻轻振荡混匀,37℃避光孵育15min。
每孔加入终止液50μL,15min内,在450nm波长处测定各孔的OD值。
结果判断
每个标准品和样本的OD值应减去空白孔的OD值。
绘制标准曲线:在Excel工作表中,以标准品浓度作横坐标,对应OD值作纵坐标,绘制出标准品线性回归曲线,按曲线方程计算各样本浓度值,再乘以稀释倍数,即为样本浓度。
试剂盒性能
准确性:标准品线性回归与预期浓度相关系数R值,大于等于0.9900。
灵敏度:最低检测浓度小于6号标准品。
特异性:不与其它可溶性结构类似物交叉反应。
重复性:板内、板间变异系数均小于15%。
贮藏:2-8℃,避光防潮保存。
有效期:6个月
免责声明
试剂盒仅供研究使用,不得用于临床实验或人体实验,否则所产生的一切后果,由实验者承担,本公司概不负责。
严格按照说明书操作,实验者违反说明书操作,后果由实验者承担。
FOR RESEARCH USE ONLY.
NOT FOR USE IN DIAGNOSTIC PROCEDURES.
Human Interleukin 4 (IL-4) ELISA Kit instru
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