荧光光谱资料.doc

第十七章 荧光光谱分析 当紫外线照射到某些物质的时候，这些物质会发射出各种颜色和不同强度的可见光，而当紫外线停止照射时，所发射的光线也随之很快地消失，这种光线被称为荧光。 西班牙的内科医生和植物学家N.Monardes于1575年第一次记录了荧光现象。17世纪，Boyle和Newton等著名科学家再次观察到荧光现象。17世纪和18世纪，又陆续发现了其它一些发荧光的材料和溶液，但是在荧光现象的解释方面却没有什么进展。1852年，Stokes在考察奎宁和叶绿素的荧光时，用分光计观察到其荧光的波长比入射光的波长稍长，才判明这种现象是这些物质在吸收光能后重新发射不同波长的光，而不是由光的漫射所引起的，从而导入了荧光是光发射的概念。同时，他由发荧光的矿物“萤石”推演而提出“荧光”这一术语。1867年，Coppelsroder进行了历史上首次的荧光分析工作，应用铝-桑色素配合物的荧光进行铝的测定。1880年，Liebeman提出了最早的关于荧光与化学结构关系的经验法则。到19世纪末，人们已经知道了600种以上的荧光化合物。20世纪以来，荧光现象被研究得更多了。例如，1905年Wood发现了共振荧光；1914年Frank和Hertz利用电子冲击发光进行定量研究；1922年Frank和Cario发现了增感应光；1924年Wawillow进行了荧光产率的绝对测定；1926年Gaviola进行了荧光寿命的直接测定等。 荧光分析方法的发展离不开仪器应用的发展。19世纪以前，荧光的观察是靠肉眼进行的，直到1928年，才由Jette和West研制出第一台光电荧光计。早期的光电荧光计的灵敏度是有限的，1939年Zworykin和Rajchman发明光电倍增管以后，在增加灵敏度和容许使用分辨率更高的单色器等方面，是一个非常重要的阶段。1943年Dutton和Bailey提出了一种荧光光谱的手工校正步骤，1948年由Studer推出了第一台自动光谱校正装置，到1952年才出现商品化的校正光谱仪器。 荧光光谱分析法除了可以用作组分的定性检测和定量测定的手段之外，还被广泛地作为一种表征技术应用于表征所研究体系的物理、化学性质及其变化情况。例如，在生命科学领域的研究中，人们经常可以利用荧光检测的手段，通过检测某种荧光特定参数（如荧光的波长、强度、偏振和寿命）的变化情况来表征生物大分子在性质和构象上的变化。 很多化合物由于本身具有大的共轭体系和刚性的平面结构，因而具有能发射荧光的内在本质，我们称这些化合物为荧光化合物。在某些所要研究的体系中，由于体系自身含有这种荧光团而具有内源荧光，人们就可以利用其内源荧光，通过检测某种荧光特性参数的变化，对该体系的某些性质加以研究。但是，如果所要研究的体系本身不含有荧光团而不具有内源荧光，或者其内源性质很弱，这时候就必须在体系中外加一种荧光化合物即所谓荧光探针，再通过测量荧光探针的荧光特性的变化来对该体系加以研究。例如，如果我们要检测体系的极性，便可以将对极性敏感的荧光探针加入到体系中，然后通过对荧光探针的荧光特性的检测，求得体系的极性，或通过探针的荧光特性的变化来表征体系的极性的变化情况。 荧光分析法之所以发展如此迅速，应用日益广泛，其原因之一是荧光分析法具有很高的灵敏度。在微量分析的各种方法中，应用较为广泛的有比色法和分光光度法。但在方法的灵敏度方面，荧光分析法的灵敏度一般要比这两种方法高2～3各数量级。随着现代电子技术的迅速发展，对于微弱光信号检测的灵敏度已大大提高，荧光分析的灵敏度常可达亿分之几，在与毛细管电泳分离技术结合、采用激光诱导荧光检测法时，已能接近或达到单分子检测的水平[1]荧光分析法的另一个优点是选择性高。这主要是对有机化合物的分析而言。吸光物质由于内在本质的差别，不一定都会发荧光，况且，发荧光的物质彼此之间在激发波长和发射波长方面可能有所差异，因而通过选择适当的激发波长和荧光测定波长，便可能达到选择性测定的目的。另外，由于荧光的特性参数较多，除量子产率、激发与发射波长之外，还有荧光寿命、荧光偏振等。因此，还可以通过采用同步扫描、导数光谱、三维光谱、时间分辨和相分辨等一些荧光测定新技术进一步提高测定的选择性。除灵敏度高和选择性好之外，动态线性范围宽，方法简便，重现性好，取样量少，仪器设备不复杂等等，也是荧光分析法的优点。 近年来，在其他学科迅速发展的影响下，激光、微处理机、电子学、光导纤维和纳米材料等方面的一些新技术的引入，很大程度上推动了荧光分析法在理论和应用方面的进展，促进了诸如同步荧光测定、倒数荧光测定、时间分辨荧光测定、相分辨荧光测定、荧光偏振测定、荧光免疫测定、低温荧光测定、固体表面荧光测定、近红外荧光分析法、荧光反应速率法、三维荧光光谱技术、荧光显微与成像技术、空间分辨荧光技术、荧光探针技术、