Lamb蛋白质芯片ELISA资料.ppt

* LAMP、蛋白芯片、ELISA 一.LAMP 环介导等温扩增( loop-mediated isothermal amplification , LAMP)是2000 年开发的一种新颖的恒温核酸扩增方法，其特点是针对靶基因的6 个区域设计4 种特异引物，利用一种链置换DNA 聚合酶（Bst DNA聚合酶）在等温条件(63 ℃左右) 保温30－60分钟，即可完成核酸扩增反应。 引物 LAMP引物的设计主要是针对靶基因的六个不同的区域，基于靶基因3’ 端的F3c、F2c和Flc区以及5’ 端的Bl、B2和B3区等6个不同的位点设计4种引物。 FIP(Forward Inner Primer)：上游内部引物，由F2区和F1C区域组成， F2区与靶基因3’端的F2c 区域互补，F1C区与靶基因5’端的Flc区域序列相同。 F3引物：上游外部引物(Forward Outer Primer)，由F3区组成，并与靶基因的F3c区域互补。 BIP引物：下游内部引物(Backward Inner Primer )，由B1C和B2区域组成，B2区与靶基因3’ 端的B2c区域互补，B1C域与靶基因5’端的Blc区域序列相同。 B3引物：下游外部引物(Backward Outer Primer )，由B3区域组成，和靶基因的B3c区域互补。 通过增加2条环状引物，使LAMP的反应时间缩短近一半，提高了检测效率。 环状引物结合的区域在F2-F1或B2-B1，以Fl到F2的方向或是B1到B2的方向结合。当反应时，所有的茎环区DNA序列或与内引物杂交，或者与环状引物杂交。 原理 环介导等温扩增其扩增原理是基于DNA 在65℃左右处于动态平衡状态，任何一个引物向双链DNA 的互补部位进行碱基配对延伸时，另一条链就会解离，变成单链，在此前提下利用4 种不同的特异性引物识别靶基因的6 个特定区域，在链置换型DNA 聚合酶的作用下，以外侧引物区段的3’末端为起点，与模板DNA 互补序列配对，启动链置换DNA合成。 结果的检测 反应结束后对扩增产物的检测常使用焦磷酸酶沉淀检测（浊度检测）、荧光检测、凝胶电泳检测、实时检测。 焦磷酸酶沉淀的检测（浊度检测）：在LAMP反应过程中，dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg2+结合，产生副产物焦磷酸酶白色沉淀，研究者发现LAMP反应中焦磷酸镁沉淀的形成与所产生的DNA量之间的关系，发现两者生成量之间呈线性关系，并且焦磷酸镁沉淀在400 nm处有吸收峰，从而进行LAMP的定量检测。 荧光检测：LAMP有极高的扩增效率，可在一小时内将靶序列扩增至109～l010倍，所以当反应液中加入核酸染料SYBR Green I后，在紫外灯或日光下通过肉眼即可进行判定，如果含有扩增产物，反应混合物变绿；反之，则保持SYBR Green I的橙色不变。 琼脂糖凝胶电泳法：LAMP最终的扩增产物是茎环DNA组成的混合物，既有若干倍茎长度的茎环结构和类似花椰菜的结构。因此，LAMP的扩增产物在2%的琼脂糖凝胶上呈现的是典型的阶梯状条带。 应用 细菌核酸的检测 病毒的检测 寄生虫的检测 动物胚胎性别的鉴别 转基因食品的检测 肿瘤的检测 二.蛋白质芯片 蛋白质芯片(protein chip) , 又称蛋白质微阵列 (protein microarray) ，是指以蛋白质分子作为配基,将其有序地固定在固相载体的表面形成微阵列；用标记了荧光的蛋白质或其他它分子与之作用，洗去未结合的成分，经荧光扫描等检测方式测定芯片上各点的荧光强度，来分析蛋白之间或蛋白与其它分子之间的相互作用关系。 在蛋白质芯片的研究中，通常把抗体固化制作成“蛋白质芯片的探针”来检测多种待测蛋白质，制成抗体芯片。 蛋白质芯片的分类 按蛋白质性质分类 1. 无活性芯片：将已经合成好的蛋白质以高密度阵列点样在芯片上，进行杂交反应。 2. 有活性芯片：把生物体直接点在芯片上，并原位表达蛋白质。 按形式分类 1. 玻璃载玻片芯片（在玻璃表面构建） 2. 3-D胶芯片（在多孔凝胶垫上构建） 3. 微孔芯片（在微孔板上构建） 蛋白质芯片技术的简要操作步骤（以样品直接荧光标记为例） 1. 将各种蛋白质有序地固定于滴定板、滤膜和载玻片等各种载体上制成检测用的芯片。 2. 用标记了荧光分子的样品与芯片反应。 3. 经漂洗将未能与芯片上的蛋白质作用的成分洗去。 4. 利用荧光扫描仪测定芯片上各点的荧光强度。 5. 通过荧光强度分析蛋白质与蛋白质相互作用的关系，测定各种蛋白质。 检测方法 对于吸附到蛋白质芯片表面的