分子生物学实验技能摘要.ppt

8. Northern blot Northern blot 原理： 通过电泳的方法将不同的RNA分子依据其分子量大小加以区分，然后通过与特定基因互补配对的探针杂交来检测目的片段。 分子探针的类型 cDNA probe：杂交反应有较高的专一性。因其为双链结构，需加热变性解链。解链后只有半数DNA链与特定的mRNA杂交，另一半DNA链则与mRNA竞争，并导致DNA链的自我“退火”（既重新形成双链）。 mRNA probe（互补的RNA）：为单链结构，杂交反应专一性高，杂交链稳定，制备复杂。 Oligonucleotide probe:由DNA合成仪合成，制备简单，由于链不长，又是单链，较易穿过组织，操作方便，但杂交链因其链短而不够稳定。 首先需要从组织或细胞中提取总RNA ,或者再经过寡聚（dT）纯化柱进行分离纯化得到mRNA。然后RNA样本经过电泳依据分子量的大小对被分离，随后凝胶上的RNA分子被转移到膜上。膜一般都带有正电荷，核酸分子由于带负电荷可以与膜很好的结合。转膜的缓冲液含有甲酰胺，它可以降低RNA样本与探针的退火温度，因而可以减少高温环境对RNA降解。RNA分子被转移到膜上后须经过烘烤或者紫外交联的方法加以固定。被标记的探针与RNA探针杂交，经过信号显示后表明需检测的基因的表达。Northern blot实验中阴性对照可以采用已经过RT-PCR或基因芯片检测过的无表达的基因 Northern blot操作流程 Northern blot Northern blot 谢 谢！ * RNA酶活性的控制 为了获得高质量的真核细胞mRNA， 必须使用RNA酶抑制剂或采用破碎细胞和灭活RNA酶同步进行的方法，最大限度地降低细胞破碎过程中所释放的RNA酶的活性。同时，避免偶然引入实验室内其他潜在的痕量RNA酶也很重要。 破碎细胞和灭活RNA酶同步进行的方法：　　用强烈变性如盐酸胍或硫氰酸胍溶液能迅速溶解蛋白质，导致细胞结构破碎，核蛋白由于其二级结构的破坏而从核酸上解离下来。RNA酶可耐受多种处理等，因此可联用上述试剂，从组织中，如富含RNA酶的胰腺中，提取完整无损的RNA。 问题 可能原因 解决方法 产量太低 样本裂解或匀浆不充分 延长匀浆时间 RNA沉淀溶解不充分 65℃加热可促进溶解 A260/A2801.65 匀浆时，样本太多，而抽提液使用量太小 增加RNA抽提试剂用量 匀浆后，样本没有静置 室温静置5分钟，促进裂解反应 水相中可能有酚残留 吸取上清时应注意操作的正确性 RNA沉淀溶解不充分 加热可促进溶解 测比值时，RNA溶解在DEPC水中，低的离子浓度和PH值增加了280nm的吸光值 比值时，采用TE溶液溶解RNA RNA降解 取样操作不正确 取样后应立即抽提和冻存 样本保存不当 －80℃或液氮保存 液相中可能有RNA酶污染 采用RNA抑制剂 制胶时所用甲醛的PH值小于3.5 试剂新鲜配制 DNA污染 匀浆时，样本太多，而抽提液使用量太小 增加抽提液用量 蛋白、多糖污染 抽提时蛋白和多糖去除不彻底 RNA沉淀时，加入部分盐溶液，选择性沉淀RNA RNA抽提常见问题与解决方案 PCR 技术：聚合酶链式反应（Polymease Chain Reaction，PCR)是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法,由高温变性、低温退火及适温延伸等几步反应组成一个周期,循环进行,使目的DNA得以迅速扩增,具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。 技术原理：双链DNA在多种酶的作用下可以变性解链成单链，在DNA聚合酶与启动子的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子挎贝。 5. PCR 技术 PCR METHOD – DENATURATION STAGE High temperature separates the two strands. PCR METHOD – ANNEALING STAGE Primer length is usually ~20 nucleotides. PCR METHOD – EXTENSION STAGE Thermostable polymerase adds dNTPs one at a time at this stage. PCR METHOD - CYCLING The average number of cycles = 30 for efficiency reasons. 230 = 1.07 X 109 copies DNA Cycle 1 2 3 4