05第5章体外分析技术摘要.ppt

第5章 体外分析技术 现代医学的发展疾病诊断的革新 可在没有任何临床症状，而病人体内发生 1. 基因表达异常； 2. 受体分布异常或受体功能改变； 3. 器官代谢异常； 4. 激素水平异常 酶、神经递质 ……等异常， 可早期发现。 体外分析和影像学的发展起了很大作用 例如 癌症的早期诊断 放射免疫分析法的创立集中了放射性核素示踪技术的高灵敏度和免疫发应的高特异性 R：放射性核素标记抗原 高灵敏（10 -9~ -15 g/ml） 探测待测物上的标记信号 (标记物的放大效应) 定 义 体外分析技术是以放射核素标记（或其他非放射性标记）的配体为示踪剂，以配体和结合体的结合反应为基础，在试管内进行的微量生物活性物质的检测技术。 体外分析技术是结合了放射性核素的高灵敏度和特异性结合反应的高特异性的一种超微量分析技术，具有灵敏度高、特异性强、精密度好、应用面广、方法简便等优点。 体外分析技术定量手段 放射性测量技术 酶定量技术 化学发光定量技术 生物学基础 特异性结合反应： 抗原-抗体的免疫结合反应； 配基-受体的结合反应； 底物-催化酶之间的酶促反应； 结合体： 抗原--抗体 激素--激素结合球蛋白 受体--配体 早期的放射免疫技术是基于竞争性结合反应原理的放射免疫分析(RIA)，稍后又发展了非竞争性结合的免疫放射分析(IRMA)。该类技术具有灵敏度高、特异性强、重复性好、样品及试剂用量少、操作简便且易于标准化等优点，广泛应用于生物医学研究和临床诊断领域中各种微量蛋白质、激素、小分子药物和肿瘤标志物的定量分析，对相关学科的发展起到了极大地推动作用。 放射免疫分析法 基本原理 常用的有B%（B/B+F)，B/F，F/B，B0/B等这些反应变量都可以用作纵坐标来对应标准抗原的浓度作标准曲线，选用的反应变量不同，标准曲线的形状也不同。但是这些标准曲线都是反映的反应变量对应标准抗原浓度变化而变化的函数关系。 操作基本步骤 加样：加样总体积要保持一致，所处的介质环境也要一致。 孵育：根据不同的分析对象孵育的温度和时间不同，一般是37℃。 分离：选择好的分离方法分离游离抗原和抗原－抗体复合物。 测量：测量游离或结合物部分的放射性。 数据处理：绘制标准曲线和待测物浓度的计算。 基本方法 基本试剂 B和F的分离 分离方法的要求 分离完全、快速。 不影响免疫反应的平衡，即是要求在分离过程中不使抗原-抗体复合物解离或形成新的复合物。 受环境因素（温度、pH值等）的影响小。 操作简便，分离剂来源丰富、价廉。 RIA小结 灵敏度高 特异性好 精确的定量 方法操作简便 免疫放射分析法 放射免疫分析技术的灵敏度高、特异性强、精密度好, 常用于各种激素、微量蛋白质、肿瘤标志物和药物等微量物质的测定。但由于放射污染和危害，常用核素半衰期短，试剂盒稳定期不长等诸多不足, RIA将逐渐被取代。 非放射性标记免疫分析技术 酶标记免疫分析技术 用酶分子代替放射性核素标记抗原或抗体，进行竞争性或非竞争性免疫分析的技术。其中应用最多的就是酶联免疫吸附分析法（ELISA）。 是结合了抗原抗体高特异性和酶促反应的高敏感性的检测技术。 化学发光免疫分析技术 化学发光免疫分析技术是以化学发光物质代替放射性核素作为示踪物的超微量分析技术。 化学发光物质在氧化剂或催化剂的作用下能形成激发态产物，并在退激时将能量转化为光子的物质。 1.化学发光免疫分析 是用化学发光物质作为标记物，标记抗原或抗体，反应以后，利用碱性条件下化学发光物质在氧化物作用下可以发生单光子放射。检测光子的数量就可以反映复合物的量。 常用的化学发光物质是异鲁米那和吖啶酯。 2.化学发光酶免疫分析 和ELISA相似，用碱性磷酸酶标记抗体，经夹心法免疫反应后，带有酶的复合物作用于特殊的底物--金刚烷，使底物发射出光子。 此法光子发射持续时间较长，可靠性比较好。 标记物为具有独特荧光特性的稀土金属—镧系元素 镧系元素共有15种，应用在时间分辨荧光免疫技术种有四种 钐（Sm），铕（Eu），镝（Dy），鋱（Te） 镧系元素荧光重要特点： 1.极长的荧光衰退时间 铕：730000ns，钐：50000ns，一般荧光物质：10ns 2.200nm的Stokes位移 铕：激发光340nm，发射光613nm 荧光素的Stokes位移为273nm 3.狭