动物细胞融合与单克隆抗体要点.ppt

动物细胞融合与单克隆抗体 　　　第一节 动物细胞融合一、动物单个细胞的获得 动物细胞虽然没有细胞壁，但细胞间的连接方式多样而复杂，在进行有效的细胞融合之前，也必需获得单个分散的细胞。 组织的获得 采用各种适宜的方法处死动物，取出组织块放入小烧杯中，用剪刀将组织块剪碎成1mm3大小，用吸管吸取Hanks溶液冲下剪刀上的碎块，补加3－5ml的Hanks溶液，用吸管轻轻吸打，低速离心，弃去上清液，留下组织块。 组织的消化 通过生物化学的方法将剪碎的组织块分散成细胞团或单细胞。根据不同的组织对象采用不同的酶消化液。如最常用的有胰蛋白酶和胶原酶等。其他的酶如链霉蛋白酶、粘蛋白酶、蜗牛酶等也可用于动物细胞的消化。EDTA最适合消化传代细胞，常与胰蛋白酶使用。 胶原酶消化 是一种由细菌中提取的酶，对胶原和细胞间质有较强的消化作用，适用于消化纤维组织、上皮组织、癌组织等。 （1）向培养瓶中放入1－5mm3大小的组织块，加5ml 2000单位/ml的胶原酶干液，最终浓度为200单位/ml，pH=6.5。 （2）36.5℃水浴4－48小时，无需摇动，中间可更换酶液一次。 （3）当组织变软，分散于瓶底时，轻轻震荡即散成细胞团或单个细胞，小心倒出培养液。 （4）800r/min离心5分钟，弃上清液，重新悬浮BSS溶液中，再离心一次。 （5）加入培养液制成细胞悬浮液 二、细胞融合的方法 细胞融合的方法包括: PEG法融合 电融合 病毒介导融合 1．PEG诱导融合法 PEG诱导融合的特点：优点--成本低，勿需特殊设备；融合子产生的异核率较高；融合过程不受物种限制。缺点--过程繁琐，PEG可能对细胞有毒害。 PEG的作用机理：① PEG分子具有轻微的负极性，故可以与具有正极性基团的水、蛋白质和碳水化合物等形成H键，从而在原生质体之间形成分子桥，其结果是使原生质体发生粘连进而促使原生质体的融合；② PEG能增加类脂膜的流动性，也使原生质体的核、细胞器发生融合成为可能。 操作步骤 融合液： CaCl2·2H2O 8~10mmol KH2PO4 0.7mmol 甘露醇或山梨醇 0.5~1.0mol pH 5.6 诱导液： 融合液＋PEG 20～45％ 稀释液：A液（g/100ml）pH6.0 葡萄糖 7.21 CaCl2·2H2O 0.79 DMSO 10ml B液（g/100ml）pH10.5 甘氨酸 0.375 NaOH 0.169 2．电融合 首先，通过双向电泳使细胞间的接触变得非常紧密(高频交流电)。在活细胞等微粒的内部，诱导去极化，引起细胞聚集，排列成串珠状，互相紧密接触。 然后给予短暂的高压脉冲，引起细胞膜的穿透，随后细胞膜发生结合导致细胞融合。为了稳定这个过程，在短期内需要施加交流电压。 电融合的优点 与PEG融合比较起来，电融合有三大优点： 1、不存在对细胞的毒害问题； 2、融合效率高； 3、融合技术操作简便 电融合的基本过程 细胞膜的接触：当原生质体置于电导率很低的溶液中时，电场通电后，电流即通过原生质体而不是通过溶液，其结果是原生质体在电场作用下极化而产生偶极子，从而使原生质体紧密接触排列成串； 膜的击穿：原生质体成串排列后，立即给予高频直流脉冲就可以使原生质膜击穿，从而导致两个紧密接触的细胞融合在一起。 关于融合参数：电融合中的主要参数包括交流电压、交变电场的振幅频率、交变电场的处理时间；直流高频电压、脉冲宽度、脉冲次数等。 三、杂种细胞的筛选 原理：两种亲本细胞融合的混合物中可能有多种类型细胞，筛选的目的是获得优良的杂种细胞。 1）亲本 2）同核体：同源原生质体的融合体 3）异核体：非同源的原生质体的融合体 4）多核体：含有双亲不同比例核物质的融合体 5）异胞质体：具有不同胞质来源的杂合细胞。 6）核质体：有细胞核而带有少量细胞质的亚原生质体 动物细胞的筛选方式： 1）利用抗药性筛选系统：利用生物细胞对药物敏感性差异筛选杂种细胞。 亲本A：对氨苄青霉素敏感，对卡娜霉素不敏感 亲本B：对卡娜霉素敏感，对氨苄青霉素不敏感 杂种细胞可以在含有两种抗生素的培养基上生长 2）营养互补筛选系统：细胞在缺乏一种或几种营养成分时，不能生长繁殖，即营养缺陷型细胞。利用两种亲本细胞营养互补作用原理可以筛选杂种细胞。 亲本A：色氨酸缺陷型 亲本B：苏氨酸缺陷型 杂种细胞可以在不含色氨酸和苏氨酸的培养基上培养，而亲本细胞均会死亡。 3）温度敏感突变型杂种细胞的筛选：一般的培养细胞能在32度到40度的范围内生长，但