PCR技术的原理、操作及应用要点.ppt

PCR技术的原理、操作及应用 西南大学 生命科学学院 范 迪 2013.04.11 分子生物学 什么是PCR PCR: Polymerase Chain Reaction，即聚合酶链式反应 是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术 PCR技术的发展历史 关于PCR 的文章首次由美国科学家 Kary Mullis等人在 《Science》杂志上发表 《Science》杂志报道了耐热性DNA多聚酶 Taq酶（生活在温泉中的水生嗜热杆菌内提取到的一种耐热的DNA聚合酶 ）的发现,预示着分子时代的到来。12月《Science》杂志将PCR和它所使用的聚合酶命名为第一个“年度分子”。 1993 Kary Mullis 因PCR的发明获得诺贝尔化学奖。 PCR技术的原理 1 遗传物质： 细胞核? 染色体? DNA（脱氧核糖核酸和磷酸链和碱基构成) 碱基（A、T、C、G）是按双链螺旋排列的，碱基序列的长度和排列的顺序决定了生物的多样性。 比如人类体细胞中共有31亿个碱基对，按上述的0.1%的差，人和人之间有3百万个碱基对的差别。 DNA双螺旋结构和遗传密码子的发现，开创了分子生物学的时代。 PCR技术的原理 2 A—T G—C A A A-T A-T A—T C—G C—G G—C G—C A—T T T A—T G—C C—G A-T A-T A—T C—G G—C G—C A -T A—T G—C T—A C—G T—A A-T A-T A—T C—G G—C G-C 基本原理 DNA的半保留复制原则 碱基互补配对原则 A=T，G=C PCR的基本工作原理就是以拟扩增的DNA分子为模板，以一对分别与模板互补的寡核苷酸片段为引物，在DNA聚合酶的作用下，按照半保留复制的机理沿着模板链延伸直至完成新的DNA合成。 PCR技术的原理 3 PCR反应的体系 包括7种基本成分： 模板 （Template DNA） 引物 （Primer） Taq DNA聚合酶 dNTP Taq聚合酶缓冲液 （Taq Buffer） PCR技术的原理 4 基本反应步骤 ： 变性(denaturation) -高温下将模板DNA双链打开 退火(annealing) -引物在较低温度下以共价键结合到模板DNA互补部位 延伸(extension) -Taq酶作用下，不断向引物3’端添加dNTP，DNA链不断延伸 PCR技术的原理 5 1 2 3 4 5 22 55 72 94 时间（min） 温度 （℃） 适温延伸 3 高温变性 1 低温退火 2 重复1~3步 25~35轮 目的DNA片段 扩增100万倍以上 DNA双螺旋 DNA单链 与引物复性 DNA变性 形成2条单链 子链延伸 DNA加倍 以温度变化来控制反应阶段 PCR技术的优点 优点: 特异 灵敏度高 皮克(pg=10-12)量级扩增到微克(ug=10-6)水平 能从100万个细胞中检出一个靶细胞 病毒检测的灵敏度可达3个RFU 简便、快速、自动化 一次性加好反应液，2～4 小时完成扩增 扩增产物一般用电泳分析 对标本的纯度要求低 血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等组织的粗提DNA PCR技术的局限性 为了构建特定引物，使特定DNA序列的选择性扩增，必须有一个庞大的已知序列的数据库。 聚合酶链反应效率差异很大，根据不同的因素需要优化反应条件。 PCR技术扩增产物的长度有限。 标准的PCR反应体系 10×扩增缓冲液 　 5 ul 模板DNA 　　　 　 0.1～2 ug 引物 　　　　 　 各10～100 pmol 4种dNTP混合物 　 各200 umol/L Taq DNA聚合酶 　 2.5 U　 Mg2+　　　　　　 1.5 mmol/L 加双蒸水至 　 50 ul 可以按照比例放大或者缩小体系，不同的PCR反应需要优化 按照实验方案进行即可 PCR循环参数 94 ℃，3min；94 ℃，45s；58 ℃，1min； 72 ℃，1min；循环30次72 ℃，10min；16 ℃保温 （热力学参数） 94 ℃，3min；94 ℃，45s；58 ℃，1min； 循环30次72 ℃，1min；72 ℃，10min；16 ℃保温 94 ℃预变性，3min使DNA双链完全打开 退火： 58℃，1min 温度由引物长度和GC含量决定。 增加温度能减少引物与模板的非特异性结合，降低温度可增加反应的灵敏性。 变性： 94 ℃变性，45s 使双链DNA解链为单链 延伸：72 ℃，1mi