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实验二 聚合酶链式反应（PCR）技术 1. 实验目的 2. 实验原理 3. 实验仪器、材料与试剂 4. 实验步骤 5. 实验结果与讨论 实验目的 掌握PCR反应的原理及技术。 实验原理 聚合酶链式反应（polymerase chain reaction）简称PCR技术，是一种体外扩增特异DNA片段的技术，实际上是在模板DNA、引物和4种脱氧核苷酸存在的条件下依赖于DNA聚合酶的酶促合成反应。 反应分为三步： 1.变性：在高温条件下，DNA双链解离形成单链DNA； 2.退火：当温度突然降低时引物与其互补的模板在局部形成杂交链； 3.延伸：在DNA聚合酶、dNTPs和Mg2+存在的条件下，聚合酶催化以引物为起始点的DNA链延伸反应。 以上三步为一个循环，每一循环的产物可以作为下一个循环的模板，几十个循环之后，介于两个引物之间的特异性DNA片段得到了大量复制，数量可达到106-7个拷贝。 PCR技术的参数主要有7个： 1 反应buffer 2 聚合酶 3 引物 4 dNTPs 5 二价离子 6 模板 7 一价离子。 实验仪器、材料与试剂 （一）仪器 1. PCR仪 2. 台式离心机 3. 微量取液器 （二）材料 模板DNA （三）试剂 1. 10x PCR buffer 2. dNTPs 2.5mM 3. Taq 酶 1u/μl 4. 引物1和2( 5μmol/L) (p1,p2) 5. 模板 实验步骤 1. 在0.2ml Eppendorf管内配制25?l反应体系 ddH2O 15 ?l 10x PCR buffer 2.5 ? l dNTPs（2.5mM） 2 ? l 引物p1 (5?M) 2 ? l 引物p2 (5?M) 2 ? l 模板DNA 1 ? l Taq 酶： 0.5 ? l Total 25 ? l 2. 按下述循环程序进行扩增 94℃ 5分钟，1个循环 94℃ 10秒，56℃ 20秒，72℃ 60秒，30个循环； 72℃ 延伸10 分钟。 25℃保温。 3. 扩增结束后取25μl扩增产物，加4μl加样缓冲液，点入1.0%琼脂糖的凝胶孔中， 100V电压电泳45分钟，EB染色后检测DNA扩增情况。 实验结果与讨论 观察实验结果并分析。 PCR引物设计 * * PCR：变性－退火－延伸 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 M
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