流式细胞仪常用技术方法.doc

细胞周期/DNA分析（PI法） 制备来设定流式细胞仪的十字门的范围：没有染色的细胞实验步骤标准做法是将细胞悬液加入预冷70％酒精加入Triton X-100以增加膜的通透性nase-A约3ul至终浓度50ug/ml，37℃水浴消化30min； 7.加入PI约50ul至终浓度约为5-50ug/ml，室温避光染色30min； 8.用300目滤网过滤，上机检测。 细胞周期/DNA分析(BD公司CycleTEST PLUS DNA Reagent Kit) 制备来设定流式细胞仪的十字门的范围：没有染色的细胞实验步骤制备来设定流式细胞仪的十字门的范围：没有染色的细胞实验步骤20μl荧光抗体。室温避光保存20分钟。 3.加入1×红细胞溶解液450μl，涡旋混匀避光保存10min，待管内液体透亮，300-500g离心5min，去上清 4.加PBS 2mlPBS涡旋混匀，300-500g离心5min，弃上清，然后加0.5mlPBS摇匀。过300目尼龙网，4℃避光1h内上机检测；若不能及时上机，加入0.5ml含1%多聚甲醛的PBS，放4℃冰箱保存，48h内上机检测。 Annexin V/PI双染色法检测细胞凋亡（BD公司Annexin-FITC/PI试剂盒） 细胞凋亡早期改变发生在细胞膜表面，目前早期识别仍有困难。这些细胞膜表面的改变之一是磷脂酰丝氨酸（PS）从细胞膜内转移到细胞膜外，使PS暴露在细胞膜外表面。PS是一种带负电荷的磷脂，正常主要存在于细胞膜的内面，在细胞发生凋亡时细胞膜上的这种磷脂分布的不对称性被破坏而使PS暴露在细胞膜外。Annexin V是一种Ca+依赖的磷脂结合蛋白，最初发现是一种具有很强的抗凝血特性的血管蛋白，Annexin V具有易于结合到磷脂类如PS的特性。对PS有高度的亲和性。因此，该蛋白可充当一敏感的探针检测暴露在细胞膜表面的PS。PS转移到细胞膜外不是凋亡所独特的，也可发生在细胞坏死中。两种细胞死亡方式间的差别是在凋亡的初始阶段细胞膜是完好的，而细胞坏死在其早期阶段细胞膜的完整性就破坏了。因此，可以建立一种用Annexin V结合在细胞膜表面作为凋亡的指示并结合一种染料排除试验以检测细胞膜的完整性的检测方法。制备三个质控样本来设定流式细胞仪的荧光补偿和设置十字门的范围：a) 没有染色的细胞; b) 仅用荧光标记的annexin V染色的细胞; c) 仅用PI染色的细胞. 三、实验步骤1.细胞收集：悬浮细胞直接收集到10ml的离心管中，1000r/min离心min，，1000r/min离心min，然后用1×bind buffer重悬细胞，配成样本细胞数为（1~5）×106/mL。2.用100ul细胞×105个cell）到离心管中。3.室温下避光孵育15min。4.结果判断：凋亡细胞对所有用于细胞活性鉴定的染料如PI有抗染性，坏死细胞则不能。细胞膜有损伤的细胞的DNA可被PI着染产生红色荧光，而细胞膜保持完好的细胞则不会有红色荧光产生。因此，在细胞凋亡的早期PI不会着染而没有红色荧光信号。正常活细胞与此相似。在双变量流式细胞仪的散点图上，左下象限显示活细胞，为（FITC-/PI-）；右上象限是非活细胞，即坏死细胞，为（FITC+/PI+）FITC-/PI+）；而右下象限为凋亡细胞，显现（FITC+/PI-）。Caspase-3-FITC 检测细胞凋亡 （BD公司FITC-CONJUGATED MONOCLONAL ACTIVE CASPASE-3 ANTIBODY APOPTOSIS KIT I） 制备来设定流式细胞仪的十字门的范围：没有染色的细胞实验步骤 蚌埠医学院科研中心 流式细胞仪 第 1 页 共 6 页