第7章花药和花粉培养.doc

第7章 花药和花粉培养 花药和花粉培养都是指花粉在培养基上改变其正常发育和机能，不经受精发生细胞分裂，由单个花粉粒发育成完整植株的技术。 花粉粒的发育过程： 减数分裂 花粉母细胞─── →四分体→花粉粒(单核,n) （单核期） (2n) (n) ↙↘ 生殖细胞(n) 营养细胞(n) (双核期，二核花粉粒） ↙↘ 精子(n) 精子(n) （三核花粉粒） 第1节 花药培养(单雄生殖) 1 花药培养的一般程序 1）采花粉在单核期左右的花蕾或幼穗； 2）保湿条件下低温等预处理； 3）取出花药表面消毒； 4）将花药接种到适宜的培养基上，在适宜温度下培养（有时需短时预培养）； 5）花粉胚或花粉愈伤组织发育到适当阶段后，转入植株再生培养基，形成花粉植株； 6）染色体加倍； 7）移入土壤栽培。 禾本科植物花粉植株的诱导一般过程: 花药 ↓ 含有2,4-D (1~2mg/L)的诱导培养基，蔗糖浓度依植物种类不同而异(2~12%) ↓ 愈伤组织 ↓10~15d,长到直径约1.5~2.0mm时 分化培养基：去掉2,4-D,加入(0.2mg/L)NAA和(1mg/L) KT ↓ 愈伤组织表面陆续出现绿色芽原基 ↓ 芽原基萌发,长成绿色的芽 芽分化的同时或稍后,同一块愈伤组织的下部一般会有根的分化. 2 影响花药培养成功的因素 2.1 材料的选择 1) 亲本植株的基因型 2) 亲本植株的生理状态 3) 花粉的发育时期 ：多数在单核期较易培养成功。 2.2 预处理 常用低温冷藏,可以提高诱导率.不同材料所需温度和时间不同。 还有离心、乙烯利、高温、甘露醇预处理等。 2.3 材料的表面消毒 常用条件: 1) 漂白粉饱和液的上清液浸泡10~15min; 2) 8~10%的安替福民水溶液浸泡5~10min; 3) 0.1%升汞浸泡10min. 2.4 培养基 基本培养基常用：H（烟草）、N6（禾谷类）、C17和W14（小麦）、B5（油菜）、FHG（大麦）等。 与常规培养基相比:降低铵离子浓度，调整铵态氮和硝态氮的比例；有些用麦芽糖等代替蔗糖。 植物生长物质：不同植物、不同品种之间都可能有差异。 多数禾本科植物：外源生长素，尤其2，4-D是促进花粉启动分裂、形成愈伤组织的必要条件。但细胞分裂素类不是必要条件。 其他: 多种维生素、氨基酸和其他有机附加物的添加常有利。有些花药培养中还使用活性炭. 2.5 培养方式 液体培养：液体培养基比琼脂培养基更适合于花药培养 双层培养 花药-花粉分步培养 条件培养基 2.6 培养条件： 温度： 接种后最初几天在较高温度下培养比较有利。 　光：愈伤组织诱导常以暗培养较好; 分化需要的光照长度和给光时间不同植物要求不同。 3 花粉植株的倍性及染色体加倍技术 3.1 花粉植株的倍性 　 花粉植株中倍性多样：n,2n,多倍体，非整倍体 出现二倍体的原因：主要是核内有丝分裂造成。 和接种花粉的时期、培养基中激素的种类和水平、花粉植株的发生方式,以及愈伤组织继代培养时间的长短有关. 3.2 染色体加倍技术 1）利用上述自发的核内有丝分裂; 2）秋水仙素处理：浓度范围0.02~0.4%, 处理方式和部位及使用浓度和时间等随植物种类不同而异. 3.3 花粉植株倍性的鉴定 一般是对茎尖或根尖细胞进行染色体计数；也可用其他指标 4 操作实例:烟草花药培养 选用花粉处于单核晚期(单核靠边期)的花蕾 ( 剥去花蕾萼片，消毒（70%的酒精10 s,饱和漂白粉上清液15~30min） ( 剥去花冠,将花药接种到含有1%活性碳的H