物源性SOD的提取、分离纯化及其生物学研究解析.doc

实 验 设 计 书 题 目植物源性SOD的提取、分离纯化及其生物学研究 指导老师 班 别： 11 生物技术 姓 名： 成 员 实验一．大蒜中超氧化物歧化酶的提取、分离纯化 实验原理 自然界中SOD分布极广，其含量随生物体的不同而不同，即使同一种生物的不同组织或同一组织的不同部位，其SOD的种类和含量也有很大差别。迄今为止人们已从细菌，真菌、原生动物。藻类、昆虫、鱼类、植物和动物等各种生物体内分离得到SOD。为拓宽提取SOD的原料，筛选或基因过程开发产SOD量较高的菌株 三个主要步骤： （1）原材料的预处理； （2）粗酶液的提取制备； （3）粗酶液3种方法连续纯化 （4）酶活和蛋白质含量测定 仪器、试剂及其制备 试剂 0.05mol／L磷酸缓冲液(pH为7．8使用91．5mLO．05 ml／L NaHPO4与8．5 mL O．05mol／L NaH2PO4配置而成); 氯仿一乙醇混合液(氯仿：乙醇为3：5)； 丙酮：用前冷却到4℃， 硫酸铵 葡聚糖G-75层析柱 仪器 电子天平 高速离心机，水浴振荡锅、紫外可见分光光度计。 方法和步骤 粗提取方法 磷酸缓冲液法：将蒜瓣去外膜，置于研钵中研磨至蒜泥状，加入3倍体积的磷酸缓冲液，浸泡30～45min后用6层纱布抽滤，将滤渣再用2倍体积磷酸缓冲液浸泡30 min后，6层纱布抽滤。如此反复共3次，收集3次抽滤所得滤液. 2. SOD的沉淀分离 粗酶液中加入0．6倍体积的冷丙酮，搅拌15 min，5000 r／min离心15 min，得到SOD沉淀，将SOD沉淀溶于磷酸缓冲液中，于55～60℃热处理15 min，5000 r／min离心15 min，弃去沉淀，得到SOD酶液。 3.纯化方法 硫酸铵分级盐析法：将硫酸铵晶体研磨成粉末后，称取一定质量的硫酸铵粉末缓慢加入SOD粗提液，使之达到50%的饱和度，再放置于4℃冰箱30min，10000r/min冷冻离心20min，除去杂质蛋白，取上清液，测量体积，在上清液中再加入硫酸铵粉末使之达到90%饱和度，放置于4℃冰箱2h，10000r/min冷冻离心20min，收集沉淀。将沉淀溶于5mmol/L、PH7.8磷酸缓冲液。 注：0℃下硫酸铵初浓度为0%，终浓度为50%时，每100ml溶液中加固体硫酸铵29.1g；起始浓度为50%，终浓度为90%时，每100ml溶液中加固体硫酸铵26.8g。 将提纯后的SOD溶液上葡聚糖G-75层析柱，台式记录仪每划一个峰均用试管收集。试管的SOD活性。 氯仿一乙醇沉淀法：将氯仿一乙醇混合液，按酶液体积的O．25将其加入酶液中，搅拌15 min，5000 r／min离心15 min，弃沉淀，将上清液置于试管中静10min 后测其SOD酶活力。 丙酮沉淀法：粗酶液中加入O．6倍体积的冷丙酮，搅拌15 min，5000 r／min离心15 min，得到SOD沉淀，将SOD沉淀溶于磷酸缓冲液中，于55～60℃热处理15min，5000 r／min离心15min，崎岖得到SOD酶液。测其SOD酶活力。 实验二．考?马?斯?亮?蓝?G?-?2?5?0?法测定蛋白质含量 实验原理 根据蛋白质的理化性质，有多种蛋白质定量方法。考马斯亮蓝G-250是比色法与色素法相结合的复合方法。考马斯亮蓝G-250是一种染料，在游离状态下呈棕红色，当与蛋白质结合后呈青蓝色。在一定范围内，也就是蛋白质含量在0~1000ug范围内，蛋白质-色素结合物在595nm下的吸光度与蛋白质含量成正比，所以可用比色法测定。 仪器、试剂及其制备 仪器：分析天平；铁架台；大漏斗；洗瓶；烧杯100ml×2、50ml×1；吸管10ml×2、5ml×1；胶头滴管；移液枪；离心管10个；722型分光光度计；容量瓶100ml×3；洗耳球×2；玻璃棒；记号笔。 试剂：蒸馏水、 标准蛋白质溶液：（用移液枪吸取1ml浓度为1mg/ml标准蛋白质溶液，溶于蒸馏水并定容至10ml，制成0.1mg/ml的原液）、 考马斯亮蓝G-250(0.01%)染液:（称取0.01g考马斯亮蓝G-250,溶于5ml 90%乙醇中，加入85%（m/v)的磷酸10ml,最后用蒸馏水定容至100ml（此溶液不宜久存，在常温中可放置1~2个月）；将定容好的染液过滤并装入棕色瓶中保存） 实验步骤 1.取纯化的酶液 2、0~100μg/ml标准曲线的制作： 取8支离心管，编号后，按下表加入试剂，盖塞后，将各试管中的溶液纵向倒转混匀，室温静止5min后，以管一为空白对照，在595nm 下比色测定。以标准蛋白质含量（μg）为横坐标，吸光度为纵坐标，绘出标准曲线。 管号 1 2 3 4 5 6 7 8 蛋白质标准液（ml） 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.6 0.8 1.0 蒸馏水（ml