12基因工程的基本操作程序第二节精要.ppt

归纳: 基因工程的基本操作程序 获取目的基因 从基因文库 利用PCR 化学方法人工合成 构建基因表达载体 目的基因、启动子、终止子、标记基因 将目的基因导入受体细胞 农杆菌转化法、显微注射法、 Ca2+处理 目的基因的检测与鉴定 检测：是否插入、转录、翻译 鉴定： * * 步骤一、目的基因的获取 1、从基因文库中获取 2、利用PCR技术扩增 3、人工合成 基因工程的基本操作程序 步骤二、基因表达载体的构建 组成:复制原点+目的基因+启动子+终止子+标记基因 它们有什么作用？ 常用的受体细胞： 原核生物：大肠杆菌 枯草杆菌 土壤农杆菌 真核生物：酵母菌和动植物细胞 将目的基因导入受体细胞的原理 借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。 步骤三：将目的基因导入受体细胞 转化 目的基因进入_________内，并且在 受体细胞内维持_____和_____的过程 受体细胞 稳定 表达 1、将目的基因导入植物细胞 （1）农杆菌转化法 特点: 农杆菌能感染双子叶植物和祼子植物,对大多数单子叶植物无感染能力 Ti质粒的T—DNA可转移至受体细胞并整合到其染色体上 Ti质粒 目的基因 构建 表达载体 导入 植物细胞 整合 植物细胞染色体DNA 表达 新性状 转入 农杆菌 转化过程: （2）基因枪法 基因枪法又称微弹轰击法，是利用压缩气体产生的动力，将包裹在金属颗粒表面的表达载体DNA打入受体细胞中，使目的基因与其整合并表达的方法。 常用于单子叶植物的转化方法 （2）基因枪法——微弹轰击法 特点：成本高 适用于单子叶植物 胚珠 花药 花丝 柱头 花柱 子房壁 子房 雄蕊 雌蕊 （3）花粉管通道法 植物花粉在柱头上萌发后，花粉管要穿过花柱直通胚囊。花粉管通道法就是在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合前，剪去柱头，然后，滴加DNA（含目的基因），使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞。 我国转基因抗虫棉就是用这种方法获得 2、将目的基因导入动物细胞 方法: 显微注射技术 操作程序: 提纯含目的基因表达载体 取卵（或受精卵） 显微注射 移植到子宫 早期胚胎 新性状动物 3、将目的基因导入微生物细胞 常用法：Ca2+处理 常用菌：大肠杆菌 微生物作受体细胞原因： 繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少 过程： Ca2+处理大肠杆菌 感受态细胞 表达载体与感受态细胞混合 感受态细胞吸收DNA 将目的基因导入受体细胞 1.将目的基因导入植物细胞 转化 农杆菌转化法 基因枪法 花粉管通道法 2.将目的基因导入动物细胞 显微注射技术 3.将目的基因导入微生物细胞 Ca2+处理 受体细胞 常用方法 微生物基因工程 动物基因工程 植物基因工程 比较目的基因导入不同细胞的方法 农杆菌转化法 显微注射法 Ca2+处理法 体细胞 受精卵 原核细胞 检测 ①导入检测：目的基因是否导入受体细胞 方法—— DNA分子杂交 ②表达检测 转录检测——分子杂交 翻译检测——抗原抗体杂交 分子检测法 鉴定 抗虫鉴定 抗病鉴定 活性鉴定等 个体水平的鉴定 步骤四：目的基因的表达和检测 （一）、检测 1、检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因 (关键步骤) ①.首先取出转基因生物的基因组DNA ②.用含目的基因的DNA片段用放射性同位素等作标记,以此做探针 ③.使探针和转基因生物的基因组杂交,若显示出杂交带,表明目的基因已插入染色体DNA中 （1）方法: DNA分子杂交 （2）过程: DNA 附着在膜上 硝化纤维素 探针 目的基因(含荧光素分子) 变性 DNA杂交 （如检测SARS病毒等） a b c d DNA分子杂交示意图 采用一定的技术手段，将两种生物的DNA分子的单链放在一起，如果这两个单链具有互补的碱基序列，那么，互补的碱基序列就会结合在一起，形成杂合双链区；在没有互补碱基序列的部位，仍然是两条游离的单链。 P15思考与探究 如果显示出杂交带，就表明待测样品含有目的基因或目的基因已经转录。 （二）、鉴定（个体生物学水平） 2、检测目的基因是否转录出了mRNA 3、检测目的基因是否翻译成蛋白质 抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等 ①方法: 分 子 杂 交 方法: 抗原抗体杂交 ②过程: 用上述探针和转基因生物的mRNA杂交,若出现杂交带,表明目的基因转录出了mRNA 　　1.利用大肠杆菌可以生产出人的胰岛素，联系前面有关细胞器功能的知识，结合基因工程操作程序的基本思路，思考一下，若要生产人的糖蛋白，可以用大肠杆菌吗？ 　　有些蛋白质肽链上有共价结合的糖链，这些糖链是在内质网和高尔基复合体上加工完成的，内质网和高尔基复合体存在于真核细胞中，大肠杆菌不存在这两种细胞器，因此，在大肠杆菌中生产这种糖蛋白是不可能的。 寻