PCR技术及应用资料讲解.ppt

RACE技术 RACE (rapid-amplification of cDNA ends)是通过PCR进行cDNA末端快速克隆的技术，又称锚定PCR，分为5’ RACE和3’RACE 。 RACE是基于PCR技术基础上由已知的一段cDNA片段，通过往两端延伸扩增从而获得完整的3‘端和5’端cDNA的方法。 具体步骤如下： cDNA第一条链的合成：利用5’ 端磷酸化的特异引物对mRNA进行反转录形成5’ 端磷酸化的cDNA第一链。 cDNA第二条链的合成：第二链合成的酶混合物中，含有聚合酶、RNaseH和连接酶。RNaseH消化RNA，T4 RNA连接酶将单链cDNA环化，补平dscDNA的末端。 用两对基因特异引物A1、GSP1和A2、GSP2分别进行两次PCR扩增。 用途：RACE 技术得到基因的全长cDNA序列。 5’RACE 3’RACE 人有了知识，就会具备各种分析能力， 明辨是非的能力。 所以我们要勤恳读书，广泛阅读， 古人说“书中自有黄金屋。 ”通过阅读科技书籍，我们能丰富知识， 培养逻辑思维能力； 通过阅读文学作品，我们能提高文学鉴赏水平， 培养文学情趣； 通过阅读报刊，我们能增长见识，扩大自己的知识面。 有许多书籍还能培养我们的道德情操， 给我们巨大的精神力量， 鼓舞我们前进。 * /chemistry/laureates/1993/mullis-lecture.html /chemistry/laureates/1993/mullis-autobio.html Mullis, K.B. (1990) The unusual origin of the polymerase chain reaction. Scientific American. 262 (4) 56-65. * PCR传奇－－一个生物技术的故事。 保罗·拉比诺著，朱玉贤译。上海科技教育出版社， 1998。 * 阴性对照:每次PCR实验务必做阴性对照。它包括①标本对照:被检的标本是血清就用鉴定后的正常血清作对照;被检的标本是组织细胞就用相应的组织细胞作对照。 ②试剂对照:在PCR反应混合物中不加模板脱氧核糖核酸或RNA，进行PCR扩增，以监测试剂是否污染（其能控制贮存试剂可能出现的污染或加样器被脱氧核糖核酸模板的气溶胶污染而致在吸取试剂时模板脱氧核糖核酸的混入）。 防 止 污 染 的 方 法 合理分隔实验室:将样品的处理、配制PCR反应液、PCR循环扩增及PCR产物的鉴定等步骤分区或分室进行，特别注意样本处理及PCR产物的鉴定应与其它步骤严格分开。最好能划分①标本处理区;②PCR反应液制备区;③PCR循环扩增区;④PCR产物鉴定区。其实验用品及吸样枪应专用，实验前应将实验室用紫外线消毒以破坏残留的脱氧核糖核酸或RNA。 吸样枪:吸样枪污染是一个值得注意的问题。由于操作时不慎将样品或模板核酸吸入枪内或粘上枪头是一个严重的污染源，因而加样或吸取模板核酸时要十分小心，吸样要慢，吸样时尽量一次性完成，忌多次抽吸，以免交叉污染或产生气溶胶污染。 预混和分装PCR试剂:所有的PCR试剂都应小量分装，如有可能，PCR反应液应预先配制好，然后小量分装，-20℃保存。以减少重复加样次数，避免污染机会。另外，PCR试剂，PCR反应液应与样品及PCR产物分开保存，不应放于同一冰盒或同一冰箱。 防止操作人员污染，使用一次性手套、吸头，小离心管应一次性使用。 设立适当的阳性对照和阴性对照，阳性对照以能出现扩增条带的最低量的标准病原体核酸为宜，并注意交叉污染的可能性，每次反应都应有一管不加模板的试剂对照及相应不含有被扩增核酸的样品作阴性对照。 减少PCR循环次数，只要PCR产物达到检测水平就适可而止。 选择质量好的Eppendorf管，以避免样本外溢及外来核酸的进入，打开离心管前应先离心，将管壁及管盖上的液体甩至管底部。开管动作要轻，以防管内液体溅出。 PCR缺点 扩增DNA的长度一般不超过2kb 一定的错配率 容易受外源DNA的污染 不能全自动化 PCR常见问题总结 PCR产物的电泳检测时间一般为48h以内，有些最好于当日电泳检测，大于48h后带型不规则甚至消失。 假阴性，不出现扩增条带 PCR反应的关键环节有: ①模板的制备 ②引物的质量与特异性 ③酶的质量及活性 ④PCR循环条件 还可能有人员操作或仪器的因素。 模 板 ①模板中含有杂蛋白质 ②模板中含有Taq酶抑制剂 ③模板中蛋白质没有消化除净，特别是染色体中的组蛋白 ④在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚 ⑤模板核酸变性不彻底 在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应固定不宜随意更改。 酶失活