不同地理位置的微生物差别资料讲解.ppt

取自中国不同地区活性污泥样本中细菌群落的 焦磷酸测序分析 蒋一凡刘苗苗熊蓓蓓 材料：活性污泥 来源:8城市，10市政WWTPs，曝气池 东部 西北 北部：SJZ（工废） 这些WWTPs主要处理生活污水，大多数WWTPs采用（A/O，A/A/O，OD） 样本处理：无菌塑料瓶（11） -80℃ 一个晚上 干冰运输 实验室 WX（CAST） MAS SZ（工废，SBR） HF（工废） NJ LZ（工废，CASS） ULMQ（AB） 研究目标 估计来自不同地理位置样本的细菌群落组成的相似性和差异性 获得活性污泥样本中微生物相互作用的更好理解 研究意义 研究这些复杂又多样化群体物种（共生模式）之间的相互作用能够很好地理解在污水处理过程中这些细菌群体的作用 作用：细菌在活性污泥中起主导因素而且在去除有机污染物，毒素和营养素起到重要作用 对活性污泥中细菌组成的更好理解可以提供有用的信息去改善污水处理效率以及阐明微生物对活性污泥的形成，发展和功能的影响 研究方法的确定 第二代高通量测序：提供足够的序列长度来覆盖复杂的微生物群体 网路分析：分类关系是活性污泥中细菌群落形成的主导因素 研究方法及过程 DNA提取 PCR扩增（聚合酶链式反应） 焦磷酸测序 序列分析 数据分析 网路分析 各研究方法的目的 高通量测序：活性污泥样本中细菌群落的组成 NMDS和ANOSIM：活性污泥中细菌群落构成的显著的地理性差异 16s rRNA基因检测技术：细菌多样性 网路分析：10个污水厂中细菌的共生模式 DNA提取 50ml样本，4000rpm（4℃）离心15min 将悬浮液倒出，每个样本的三倍颗粒量（大约0.3g）用来DNA提取 0.8%琼脂糖凝胶电泳：原DNA分析 土壤微生物DNA强力提取试剂盒(人工指令):相同样本中抽取的三份DNA进行结合和提纯 生物光度计：分析提取DNA的质量 PCR扩增 细菌的16S rRNA基因扩增： 引物533R（5’-TTACCGCGGCTGCTGGCAC-3’） 引物27F（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCA G-3’） 533R：Roche 454“A”焦磷酸序列适配物，唯一的10 个碱基对序列 27F：Roche 454“B” 反应体系（50 μl）：10 μl 5× Prime STAR Buffer (Mg2+Plus），0.2 mM dNTP，0.4 μM的每个正向和反向引物，2.0 U TaKaRa Prime STAR HS DNA 聚合酶 ，100–200 ng DNA模板 循环条件：95°C初始变性5min，94°C 进行24个变性周期30s，55°C退火30s，72°C扩展30s，72°C 扩展5min PCR产物：2%琼脂糖凝胶检查，DNA凝胶提取试剂盒提纯 焦磷酸测序 扩增子库：三个独立PCR产物的混合物 目的：使潜在的场PCR误差最小化 不同污泥样本的扩增子混合 目的：实现同等质量浓度 合并后的样本被送到上海的Majorbio公司进行基于Roche 454 FLX钛平台的焦磷酸测序 获得的原始数据已经存入NCBI short-reads归档数据库(加入数字：SRX450095） 序列分析 获得的序列数据使用Mothur1.30然后454SOP进行处理 在进一步分析中排除：不包含精确匹配到引物的序列，含有任何模棱两可的读数和/或者拥有平均质量分数少于27且少于200个核苷酸(除了引物/碱基对序列区域)的序列 how? 两两母体的距离用Mothur计算，在3%的距离使用更进一步的临界方法，获得的数据集中到OTUs 序列被随意二次抽样,所获得的序列的最小值 进行alpha和beta多样性分析 数据分析 二次抽样的序列被用来分析alpha的多样性，包括使用Mothur中的summary.single指令进行Chao1和Good’s的覆盖率估计 NMDS分析使用R vegan（版本：2.15.0）来研究细菌群落组成的相似性。0.2的应力水平对于NMDS情景是可以被接受的。相似性分析被用来检测不同群落的细菌群落组成的差异性（如西北和东部群落），相似度分析用来识别OTUs，OTUs指定西北或者东部样本。