1.2基因工程基本操作程序(新).ppt

常用的受体细胞： 微生物细胞：大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌等； 动物细胞； 植物细胞； 三、将目的基因导入受体细胞 1、将目的基因导入植物细胞 （1）农杆菌 转化法 特点: 能感染双子叶植物和祼子植物,对单子叶植物无感染能力 农杆菌中的Ti质粒上的T-DNA可转移至受体细胞并整合到其染色体上 转化过程: Ti质粒 目的基因 构建 表达载体 导入 植物细胞 插入 植物细胞染色DNA 表达 新性状 转入 农杆菌 植物组织培养 （2）基因枪法 基因枪法又称微弹轰击法，是利用压缩气体产生的动力，将包裹在金属颗粒表面的表达载体DNA打入受体细胞中，使目的基因与受体细胞基因组整合并表达的方法。 适用于单子叶植物 （3）花粉通道法 植物花粉在柱头上萌发后，花粉管要穿过花柱直通胚囊。花粉管通道法就是在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合前，剪去柱头，然后，滴加DNA（含目的基因的基因表达载体），使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞。 适用于被子植物 2、将目的基因导入动物细胞 方法: 显微注射技术 操作程序: 提纯含目的基因表达载体 动物的受精卵 显微注射 移植到代孕母体的子宫 胚胎发育 新性状动物胚胎早期培养 转入生长素基因 新性状动物 3、将目的基因导入微生物细胞 常用法：Ca2+处理法/CaCl2法/感受态细胞法 常用菌：大肠杆菌 微生物作受体细胞原因： 繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少 过程： Ca2+处理大肠杆菌 感受态细胞 表达载体与感受态细胞混合 感受态细胞吸收DNA 思考：为什么要用Ca2+处理受体细胞？ 用Ca2＋处理，增加细菌细胞壁的通透性 1.2 基因工程的基本操作程序 基因工程基本操作的四个步骤 1、目的基因的获取 2、基因表达载体的构建 3、将目的基因导入受体细胞 4、目的基因的检测与鉴定 1、目的基因：主要指的是编码蛋白质的结构基因，也可以是一些具有调控作用的因子。 2、获取方法： （1）从基因文库中获取目的基因； （2）利用PCR技术扩增目的基因； （3）用化学方法人工合成目的基因。 一、目的基因的获取 基因文库 gene library 基因组文库 部分基因文库（如cDNA文库） 将含有某种生物不同基因的许多DNA片段,导入受体菌的群体中储存,各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因,称为基因文库(gene library) 注意：是通过对受体菌的培养而储存基因，而不是直接保存基因 基因组文库: 基因文库中包含了一种生物所有的基因,这种基因文库叫做基因组文库.（比较大） 部分基因文库: 基因文库中包含了一种生物的一部分基因,这种基因文库叫做部分基因文库.（比较小） 如，cDNA文库。 构建基因文库的目的： 为了在不知道目的基因序列的情况下，便于获得所需的目的基因。 基因文库： 思考：基因文库如何构建？ 将某种生物体内的DNA全部提取出来，选用适当的限制酶或机械力量将DNA切成一定范围大小的DNA片段，然后，将这些DNA片段与合适的载体在体外重组后，导入受体菌的群体中储存，每个受体菌都含有了一段不同的DNA片段。也就是说，这个群体包含了这种生物的所有基因，这样就构建成了生物的基因组文库。 （1）基因组文库的构建 提取某生物 全部DNA 用适当 限制酶切割 许 多 DNA片段 与载体连接 导入受体菌群 该生物 基因组文库 （每个受体菌含有一段不同的DNA片段） （常用于原核生物） （2）cDNA文库的构建 mRNA （某一发育时期） 逆转录酶 杂交双链 核酸酶H 单链DNA （cDNA单链） DNA聚合酶 双链DNA (cDNA双链) 与载体连接 导入受体菌群 该生物 cDNA文库 如果用某种生物发育的某个时期的mRNA反转录产生的多种互补DNA（也叫cDNA）片段，与载体连接后储存在一个受体菌群中，那么，这个受体菌群体就构成了这种生物的cDNA文库。 （构建过程中需要使用反转录法（逆转录法）） 思考：基因文库如何构建？ (常用于真核生物) 基因组DNA文库 cDNA文库 构建基因组DNA文库、cDNA文库 基因组文库与部分基因文库的比较 (1)原核细胞的基因结构 非编码区 非编码区 编码区 编码区上游 编码区下游 与RNA聚合酶结合位点 启动子 终止子 启动子：位于基因的首端的一段特殊的DNA片断，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得蛋白质 终止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片断，能终止mRNA的转录 (1)原核细胞的基因结构 非编码区 非编码区 编码区 编码区上游 编码区下游 与RNA聚合酶结合位点 启动子 终止子 RNA聚合酶: