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第十三章   Ribozyme DNAzyme 第一节 ribozyme 一 ribozyme 的发现： 1982 Cech 发现嗜热四膜虫26s RNA前体（413nt，有2个外显子，中间有一个内含子(或间隔序列，IVS) ）在成熟过程中无需酶的催化，但需5’-GMP 和Mg2+ 。这一反应被 称为自我剪切反应，是在26s RNA前体的IVS催化下完成的。 1983 Atlman 发现tRNA成熟酶(RNA酶P)的RNA具有催化功能。 Pr：119aa RNA酶P RNA：377nt，在[Mg 2+]20mmol / L 时 具有全酶的功能。 为了证明RNA中无蛋白所做的工作： ① 把分离出的RNA制剂用含SDS的苯酚抽提 ② 用蛋白酶处理 ③ 催化反应在0.1%的SDS溶液中进行 ④ 通过体外重组合成的RNA 同样具有催化功能 1989年，Sidney Altman 和Thomas Cech共同获得Nobel 化学奖 二 ribozyme的类型及作用机制 (一)自我剪接型（self splicing): 1. Ⅰ型: 催化需5’-GMP 和Mg 2+ 参加 代表：来自四膜虫26SrRNA前体L19-IVS 催化机制： L19-IVS是一个多功能催化剂: ①转核苷酸作用： 2 (Cp)4C ? (Cp)5C + (Cp)3C ②水解作用：(Cp)4C ? (Cp)3C + pC ③转磷酸作用： (Cp)6 + UpCpU ? (Cp)5C + UpCpUp ④去磷酸作用： (Cp)5C ? (Cp)4C + Pi ⑤RNA限制性内切酶功能: -CpUpCpUpN- + G ? -CpUpCpU + GpN- 特点: ①高度底物专一性： 与底物的识别是通过碱基配对方式 L19-IVS 对polyC6专一性比polyU6专一性高，对polyA6和polyG6不作用 ——活性中心是富含G的片断: 5’- GGAGGG - 3’ ② 属于I型的核酶都有着十分相似的二、三级 核心结构 ③ 服从米氏动力学 ? 对竞争性抑制剂敏感 2. II型ribozyme： II型ribozyme在催化剪接反应时不需要鸟苷酸，但需要Mg2+ 催化机制： （二） 自我剪切型（self cleavage)： 自我剪切型：只有剪切，没有连接过程。 代表：RNaseP的 M1RNA；噬菌体 RNA前体等 催化特点：形成特定的二、三级结构 ： 1. 锤头结构（hammerhead structured)： 3. 环状ribozyme： 丁型肝炎病毒（HDV）RNA为~1700nt的环状结构，也能自剪切，但不形成上述两种结构。属于环状核酶。 催化：以一个胞嘧啶碱基上的N3作为一般的碱进行催化 产物：3’-端为2’，3’环磷键，5’端为羟基 其它环状核酶： 植物病毒卫星RNA、类病毒RNA含有自我分裂顺序，可精确地分裂复制时产生的RNA连环体 优点：比线状RNA稳定，耐核酸酶降解 （三） 别构核酶（allosteric ribozyme) 某些RNA能形成动态结构，携带一个与活性部位分开的效应因子结合部位。配体与该部位结合后，可诱导相邻核酶结构的构象变化，提高或抑制催化作用。 (四) 寡核苷酸引导的人工内切核酸酶 是由ribozyme 衍生而来的杂交分子 构成：断裂因子 —底物序列识别片段—嵌合因子三部分 靶序列：可以是RNA或单、双链DNA 底物序列识别片段：识别部位，将催化剂本身引到底物 序列处并结合。它一般是寡核苷酸片段， 也可是与 核酸专一性结合的蛋白，如阻遏蛋白等 嵌合因子：使靶序列识别片段能与底物序列形成稳定的 络合物 断裂因子：可为金属鳌合物、光活性基团或核酸酶等， 负责在特定部位切断靶序列 人工内切核酸酶结构示意图： 三 ribozyme的底物多样性： 目前发现的ribozyme可作用于包括RNA在内的多种底物： 以RN