制生物化学与分子生物学基因表达及功能分析基本策略资料讲解.ppt

基因敲入是基因打靶技术的一种，基因打靶技术是20世纪80年代后半期发展起来的，一种按预期方式准确改造生物遗传信息的实验手段。 该技术的巧妙之处在于把胚胎干细胞技术和DNA同源重组技术“结合”起来，实现对染色体上某一基因的定向修饰和改造，从而深入地了解基因的功能。 除基因敲入外，基因打靶还包括基因敲除、点突变、缺失突变、染色体组大片段删除等。 基因打靶的原理和基本步骤 首先, 从小鼠囊胚分离出未分化的胚胎干细胞, 然后利用细胞内的染色体DNA可以与导入细胞的外源DNA，在相同序列的区域内发生同源重组的原理，用含有正-负筛选标记的打靶载体，对胚胎干细胞中的特定基因实施“打靶”； 之后将“中靶”的胚胎干细胞移植回小鼠囊胚( 受精卵分裂至8个细胞左右即为囊胚, 此时受精卵只分裂不分化) , 移植进去的中靶胚胎干细胞钻入囊胚胚层, 与囊胚一起分化发育成相应的组织和器官； 最后诞生出具有基因功能缺陷的“嵌合鼠”。由于中靶的胚胎干细胞保持分化的全能性, 因此它可以发育成为嵌合鼠的生殖细胞, 使得经过定向改造的遗传信息可以代代相传。 基因打靶的原理示意图 基因功能研究的功能失活策略是通过观察，细胞或个体的某一基因功能被部分或全部失活后，细胞生物学行为或个体遗传性状表型的变化，来鉴定基因的功能。 常用的方法主要有 基因敲除 基因沉默 二、采用功能失活策略鉴定基因的功能 基因敲除（gene knock-out）属于基因打靶技术的一种，其操作步骤和原理与基因打靶技术相同。基因敲除技术是利用细胞染色体DNA可以与导入的外源DNA在相同序列的区域发生同源重组的现象，在ES细胞中定点破坏内源基因，然后利用ES细胞发育的全能性，获得带有预定基因缺陷的杂合子，通过遗传育种最终获得目的基因缺陷的纯和个体。 1987年，Thompsson首次建立了完整的ES细胞基因敲除的小鼠模型，此后基因敲除技术得到进一步的发展和完善，目前该技术已经成为研究基因功能最直接、最有效的方法之一。 （一）基因敲除可以使基因的功能完全缺失 基因被完全敲除之后使得表型分析受到很多限制： 有些重要的靶基因被敲除后会引起胚胎早期死亡，使得无法分析该基因在胚胎发育晚期和成年期的功能；某些基因在不同的细胞类型中执行不同的功能，完全敲除会导致突变小鼠出现复杂的表型，使研究者很难判断异常的表型是由一种细胞引起的，还是由几种细胞共同引起的。 近年来，条件性基因打靶（conditional gene targeting）系统的建立，使得对基因靶位时间和空间上的操作更加明确，效果更加精确可靠，已达到对任何基因在不同发育阶段和不同器官、组织的选择性敲除。 Cre/loxP系统作用原理示意图 这一技术亦存在一些缺点： 费用太高 周期较长 许多基因在剔除后并未产生明显的表型改变，可能是这些基因的功能为其他基因代偿所致 条件性基因打靶的优势： 克服了重要基因被敲除所导致的早期致死 并能客观、系统地研究基因在组织器官发生、发育以及疾病发生、治疗过程中的作用和机制 基因沉默(gene silencing)是指由外源基因导入引起的生物体内的特定基因不表达或表达受抑制的现象。 该现象最早发现在转基因植物中，后来这种现象在线虫、真菌、果蝇、斑马鱼、小鼠早期胚胎中也有发现。 目前最常用的基因沉默技术包括： RNA干涉（RNA interference，RNAi） 反义寡核苷酸（antisense oligonucleotide，ASON） （二）基因沉默可以使基因的功能部分缺失 RNAi是指双链RNA介导同源序列的mRNA特异性降解，导致的转录后基因沉默。 RNAi是机体的一种天然防御机制，具有防御病毒感染、入侵等功能。 目前利用RNAi能够在短时间内高效特异地抑制靶基因表达的特点研究基因的功能已成为功能基因组学的热点之一。 1. RNA干涉技术可用来研究基因的功能 RNAi的作用机制： 外源dsRNA可直接被导入细胞，或者通过转基因、病毒感染等方式进入细胞，并整合到基因组中获得表达；各种来源的dsRNA被核酸酶RNaseⅢ家族中，特异识别dsRNA的Dicer酶，以一种ATP依赖的方式逐步切割成长约21~23nt的双链小干扰RNA(small interference RNA，siRNA)；siRNA识别mRNA链上的同源区域之后，结合一个核酶复合物形成RNA诱导的沉默复合体（RNA-induce silencing complex，RISC）；RISC定位到靶mRNA转录本上，并在距离siRNA 3’端12个碱基的位置切割