第四小组生化制备流程图.doc

亲和层析法纯化胰蛋白酶 实验一 鸡卵蛋白的提取 实验二 胰蛋白酶粗提取  实验三 亲和色谱分离胰蛋白酶 2 50毫克鸡卵清于250毫升烧杯中搅拌且缓加等体积10%TCA溶液稳定PH在3.5±0.2，放入4°C冰箱过夜 弃去上浮脂类物质和不溶物 滤液用1mol/L盐酸在PH计下调PH至3.5 收集上清液，滤纸过滤 弃去沉淀 沉淀离心杯与真空干燥器中，抽去残留丙酮。（沉淀变为透明胶状物） 沉淀转移到50毫升离心杯中，3000rpm离心15min 转移鸡卵蛋白与50毫升离心杯中，3000rpm离心15min,收集上清液 加三倍体积预冷丙酮，搅拌，塑料膜封口，冰箱4摄氏度静止4h 吸出上清液 弃去上清液 加入25毫升蒸馏水或20mmol/L，PH 6.5磷酸缓冲液溶解。滤纸过滤 收集沉淀，鸡卵蛋白离心杯于真空干燥器中干燥，手机成品，冰箱保存 沉淀转移到50毫升离心杯中，3000rpm离心15min 弃去上清液 透析的鸡卵蛋白液以0.1mol/L盐酸调PH4.0，量体积 加三倍体积预冷丙酮，搅拌，塑料膜封口，冰箱静止4h或过夜 收集鸡卵蛋白分离液转入透析袋，以蒸馏水透析，常换水，直到渗出液颈硝酸银检验无氯离子 将鸡卵蛋白滤液先经Sephadex G-25分离纯化，再由DEAE-Cellulose离子交换层析柱分离 弃去沉淀 滤液收集备用 加入固体氯化钙是钙离子终浓度为0.1mol/L，加入约5mg结晶胰蛋白酶，混匀，激活 弃去滤渣 弃去滤渣 纱布四层水湿润后于玻璃漏斗上，胰蛋白酶原提取过滤 转移到500毫升烧杯，2mol/L硫酸调节PH3.5-4.0,10摄氏度搅拌提取4h 转移到组织器中，加150毫升预冷的3.5%乙酸酸化水，均浆 50克猪胰脏，去除结缔组织及脂肪，净重30克左右，剪成碎块 收集滤液，以5mol/L氢氧化钠调PH为8.0，量取溶液体积 折叠纸过滤 收集滤液，以2mol/L硫酸调节绿叶PH2.5-3.0之间，4摄氏度冰箱静止沉淀4小时以上 4摄氏度冰箱激活12-16h，在25摄氏度很稳水域中激活2-4h 取1ml上清液测定蛋白浓度和活性 等酶溶液的比活性达到1000u/mg时没用2mol/L硫酸调节PH3.0 滤纸过滤 收集滤液，4摄氏度保存 滤除硫酸钙沉淀 琼脂糖凝胶层析介质的处理：称取10克琼脂糖凝胶层析介质，置于G-3玻璃烧结漏斗内 用100ml 1.0mol/L NaCl溶液抽洗（少量多次），100ml 蒸馏水抽洗，抽干后转移到100ml三角瓶中备用 向盛有介质的三角瓶中加入蒸馏水7ml，1,4二氧六环8 ml，2 mol/L NaOH 6.5ml，环氧氯丙烷1.5ml，放入45℃恒温摇床中，于160转/分钟，振摇活化2小时 停止活化，转移到G-3玻璃烧结漏斗内，抽去活化剂，用100ml蒸馏水洗（少量多次），转移100ml到三角瓶中，准备偶联 称取约100mg鸡卵粘蛋白，用10ml 0.1mol/L pH9.5 Na2CO3缓冲液充分溶解 取0.1ml稀释10倍测定OD280，计算溶液的蛋白浓度 将溶解好的鸡卵粘蛋白溶液，转移到100ml三角瓶中与活化的琼脂糖凝胶介质混匀 在40℃恒温摇床中，于160转/分钟，振摇偶联22小时左右，停止偶联 取一个洗净的500ml抽滤瓶，将已经偶联好的琼脂糖凝胶层析介质转移到G-3玻璃烧结漏斗内抽滤，收集滤液，测定滤液中剩余的鸡卵粘蛋白的含量 用100ml 1.0mol/L NaCl溶液抽洗，100ml 蒸馏水抽洗，再用20ml 亲和层析洗脱液洗涤 将亲和介质转移到50ml的小烧杯内，加入20ml 亲和层析平衡液，浸泡20分钟，脱气，装柱 装柱：取一支层析柱(10×1.0cm),将合成好的亲和层析介质CHOM-Sepharose 4B 装入柱内,自然沉降 以0.1mol／L，pH 8.0Tris-HCl缓冲液平衡 将已激活的胰蛋白酶提取液用5 mol／L NaOH精确调节pH至pH 8.0 滤纸过滤 取滤液上样 以0.1mol／L，pH 8.0Tris-HCl缓冲液平衡 洗去未被吸附的杂蛋白 等平衡到基线稳定后，用0.1mol／L，pH2.5甲酸-0.5mol／L KCl溶液洗脱 收集洗脱峰 放入层析袋内，在4°C对蒸馏水透析 测定纯胰蛋白酶浓度、活性 冻干燥成干粉