试验论文设计.doc

总黄酮的抗氧化性试验 总黄酮的提取 1、试验材料： 2、试验试剂：蒸馏水、无水乙醇、芦丁、硝酸铝、亚硝酸钠、氢氧化钠、硫酸亚铁、过氧化氢、抗坏血酸（Vc ）、磷酸缓冲液、PBS缓冲液、铁氰化钾、2 － 硫代巴比妥酸( TBA) 、三氯乙酸( TCA) 、DPPH（1,1-二苯基-2-三硝基苯肼）所用试剂均为分析纯。 3、试验仪器：试验的基本仪器（烧杯、移液管、量筒、试管、容量瓶、洗耳球、试管架、）、METT TOLEDO 320 酸度计 、THZ － 82B 气浴恒温震荡器恒温水浴锅、可见分光光度计、 循环水真空泵、离心机 3、试验方法 （1）芦丁（属于黄酮类物质，又名：芸香，维生素P）标准溶液的配制及标准曲线绘制 将芦丁标准品烘干，用60%的乙醇溶液配置0.20%mg/ml的芦丁标准溶液，准确吸取芦丁标准溶液0.00ml、1.00ml、2.00ml、3.00ml、4.00 ml、5.00 ml、6.00ml，分别置于7支25mL的比色管中，加入5%亚硝酸钠溶液1ml，摇匀，放置6min; 加入5%硝酸铝溶液1.0ml，摇匀，放置6min; 加入4% 氢氧化钠溶液10.0ml，用30% 乙醇溶液定容，摇匀，放置12～15min，备用。在510nm 处测定吸光度( A) ，以吸光度为纵坐标，芦丁标准品溶液的浓度为横坐标，绘制标准曲线，得出芦丁含量C(mg/ml)与吸光度A之间的回归方程。 （2）测定样品中黄酮含量 （3）单因素试验 黄酮提取率受很多因素的影响，为了分析影响因素A(乙醇浓度、提取时间、提取温度、物料比) 对提取率的影响，试验时让其它因素保持不变，而只让因素A 改变，利用此单因素试验找出在其他条件固定时所考察因素的最佳水平，单因素试验是正交试验的基础。分别检查乙醇浓度、提取温度、浸提时间、料液比对总黄酮提取率的影响。 （4）正交试验优化提取条件 根据单因素实验结果，设计正交试验，选出最佳提取条件。选定乙醇浓度(A)、料液比(B)、提取温度(C)、浸提时间(D)4 个因素，采用L9(3)4 正交表安排试验，因素与水平见下表：正交试验因素与水平 水平 乙醇浓度(%) 料液比(倍数) 浸提温度(℃) 浸提时间(h） 1 30 20 45 1 2 50 25 55 2 3 70 30 65 3 二、总黄酮的抗氧化性研究 试验方法：黄酮提取液抗氧化性的研究采用Fe 诱导卵磷脂脂质体过氧化－ TBA 法测定对脂质过氧化抑制率，清除羟基自由基测定采用反应比色法。 1、黄酮类化合物还原能力的测定。 在6根比色皿中各加入pH为6.6的磷酸盐缓冲液，再各加入样品液（具有一定的梯度），用蒸馏水定容至一定刻度，加入1%的铁氰化钾溶液，混合物在5O℃恒温20min后快速冷却，再加入1O %的三氯乙酸溶液，然后以3000 r／min离心10min，取上层清液加蒸馏水和的三氯乙酸溶液，在700nm处测定吸光度。 总黄酮对羟自由基(·OH)的清除试验 在7根比色皿中依次加入一定量的FeSO4溶液，1mmol/L H2O2溶液，摇匀，加人水杨酸溶液，摇匀，放入37℃精密恒温水浴槽中加热15 min后取出，测其吸光度A0； A：黄酮提取物不同添加量清除羟自由基的方法，即加入一定量的提取物（具有一定的浓度梯度），用蒸馏水定容至1OmL，摇匀，37℃ 水浴继续加热15min，取出测其吸光度Ax。 B：不同抗氧化剂清除羟自由基的方法，即分别用适量的三氯乙酸和提取物，蒸馏水定容至1OmL，摇匀，37℃水浴继续加热15min，取出测其吸光度Ax。以柠檬酸对(·OH )清除率作对比分析。待测液对羟自由基 (·OH)的清除率计算公式： (·OH)清除率／％=(A0-Ax)/A0×100 总黄酮对超氧阴离子(O2-·)的清除试验 A：黄酮提取物不同添加量清除超氧阴离子的方法，即在室温下向比色管中加入pH =8的PBS缓冲液5.0mL，然后加入一定量的提取物（具有一定的浓度梯度）和(不加提取物为空白对照），各加入适量的邻苯三酚，再加入一定量缓冲溶液使体系总体积达到一定量，然后立即混匀，再以二次蒸馏水作参比，在322nm下测定吸光值A322 (每隔30S测1次，直到反应启动后9min)，以时间为横坐标，A 值为纵坐标进行线形回归，得到直线斜率为反应速率V空和V样。 B：