《基因工程》全套课件261P.ppt

大肠杆菌表达载体类型： （1）融合性蛋白表达载体：如pRSET (2)非融合性表达载体:如:pRSET (3)分泌性表达载体：如pIN-ompA （四）真核表达载体 应至少具备两项功能： 1、能在原核细胞中进行目的基因重组和载体的扩增； 2、具有真核宿主细胞表达重组基因所需的各种转录和翻译调控元件。 真核表达载体的构件 （1）真核表达载体的基本元件 原核序列（克隆用）+ 真核序列（表达用） 复制子 真核抗药基因+真核表达组件 抗药基因 （或真核复制起始点） Promoter / Enhance + Cloning Site+Terminater + PolyA-adding Signal ① 启动子（promoter）和增强子（enhancer） 必须用真核启动子和增强子，但活性差异较大。常用病毒的 元件，如SV40病毒早期基因增强子、Rouse肉瘤病毒（RSV） 的LTR、人类巨细胞病毒（CMV）等 ②转录终止和加尾信号 真核细胞中转录后，准确地加poly（A）尾依赖于： poly（A）加尾信号 –AAUAAA poly（A）位点及其下游的GU-rich区或U-rich区 真核表达载体必须含有上两部分，以弥补内源性序列本身的不足。 常用SV40的加poly(A)信号：237bp的BamHI-Bcl I酶切位点片段，同时含有早期和晚期转录单位的切割和加polyA信号，两套信号作用相反，分别位于不同的DNA链上，对mRNA的加工均有效。 哺乳动物表达载体 1.表达载体的种类 （1）病毒载体 整合性载体：外源基因通过这种载体与宿主细胞的染色体整合。如pSV系列载体 游离型载体：外源基因与这种载体重组后，以病毒颗粒形式在宿主细胞内自行复制或在辅助病毒存在下进行复制。如痘苗病毒、腺病毒、杆状病毒等。 （2）质粒载体 常常是穿梭质粒载体。既含原核的复制位点和 筛选标记，又含真核的复制位点筛选标记和表达构件。 pcDNA3.1质粒物理图谱 第四节 重组DNA技术的基本过程 重组DNA技术的基本步骤： ① 制备目的基因和相关载体 ② 将目的基因和有关载体进行连接 ③ 将重组的DNA导入受体细胞 ④ DNA重组体的筛选和鉴定 ⑤ DNA重组体的扩增、表达和其它研究 重组DNA技术的应用目的 1.获得足够的DNA片段以分析基因的结构； 2.获得基因用于发展农业、林业、畜牧业和医学 目的基因 指要研究或应用的基因，也就是要克隆和表达的基因。 一、目的基因的制备（Isolation） （一）直接从染色体中分离 如果物理图谱已确定，可用限制酶直接从原核生物，噬菌体及动物病毒基因组切取目的基因。 （二）化学合成法 要求： 已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列 基因小 已报道的合成基因有人生长激素、干扰素、胰岛素、表皮生长因子、白细胞介素II、集落刺激因子等，这些基因均已被克隆，绝大多数已在原核和真核系统中获得表达。 优点：任意制造和修饰基因，方便设立各种接头及选择偏爱密码子。 缺点：大片段基因获得费时费力，价格贵。 （三）用逆转录酶合成cDNA 以mRNA为模板经RT合成cDNA。然后经过基因克隆，从而获得某种特定的基因。适于高丰度的mRNA。 （四）PCR或RT-PCR 根据目的基因的核苷酸序列设计一对引物以基因组DNA为模板经PCR扩增目的基因。 以mRNA或RNA为模板经RT-PCR扩增目的基因。 三种不同引物引导的RT-PCR示意图 1.从基因组文库（genomic library）筛选目的基因 采用限制酶将基因组DNA切成片段，每一个DNA片段都与一个载体分子拼接成重组DNA，然后将所有的重组体都引入宿主细胞并进行扩增，得到的分子克隆的混合体称为“基因组文库”。从基因组文库中通过杂交筛选得到目的基因片段。 从细胞中分离基因组DNA、用Sau3A或MboI部分消化、回收大小在一定范围内的片段、构建重组体。 （五）从基因组文库和cDNA文库筛选目的基因 组织或细胞染色体DNA 基因片断 克隆载体