2012实验讲义.doc

2012年环境分子生物学实验 第一部分：16S rRNA靶向变性梯度凝胶电泳指纹图谱分析微生物菌群 实验原理： 微生物菌群对于地球上甚至地球外的几乎所有环境的发展和功能是至关重要的，而针对一系列细胞生物标记物的分子微生物生态学方法的长足发展，使得对微生物群落组成和功能的监测可以不依赖于微生物的培养。过去几十年中，利用所谓的生物标记物来监测环境样本中的微生物菌群的分子微生物生态学（molecular microbial ecology）得到了快速发展。’端引入GC夹（GC-clamp）可以保护DNA片段不会完全变性。这个GC夹有30~50bp长，是在进行DGGE分析之前加到对靶基因进行PCR扩增的一个引物上的。DGGE能对微生物群落进行快速的分析和比较。利用DGGE可使组成的多样性一目了然，不同序列的片段将停留在不同的位置，其中每一条带原则上代表一种细菌系群。染色后，在凝胶中DNA分子停止迁移的位置会看到条带。理论上，DGGE指纹图谱可以区分不长于500bp的PCR扩增产物上的一个碱基对的差别。该技术在快速比较不同环境中的微生物群落和监测某一特定的群落在不同时间的组成变化中非常有效。 实验步骤： 地表水细菌基因组DNA提取 裂解液：0.05 M Tris-HCl（pH 8.0），0.1 M NaCl，0.1 M EDTA（pH 8.0），1% SDS。 Tris饱和酚：用1M Tris-HCl（pH 8.0）饱和的新鲜苯酚，含0.1%的8-羟基喹啉，pH＞7.8。 酚/氯仿/异戊醇：Tris饱和酚中加入氯仿和异戊醇，体积比为25:24:1。 无水乙醇和70%乙醇 TE：0.01M Tris-HCl，0.001M EDTA，pH8.0。 1×TAE电泳缓冲液：0.04 M Tris，0.02 M HAc，0.05 M EDTA，pH 8.0。 0.5×TBE电泳缓冲液 （1）取1.5mL×6地表水样4000r/min离心10min，弃上清，加入500 μL裂解液充分悬浮。 （2）加入500μL Tris饱和酚，混匀，室温放置10min，4000r/min离心10min。 （3）吸取上层水相转移至新离心管，加入等体积的酚/氯仿/异戊醇，颠倒混匀后4000r/min离心10min。（若有必要，可重复操作一次。） （4）吸取上层水相转移至新离心管，加入两倍体积无水乙醇，充分沉淀后10000r/min离心10min，弃去上清液。 （5）加入1mL 70%乙醇，充分悬浮后10000r/min离心10min，弃去上清液，晾干10min。加入50μL TE溶解，得到细菌基因组DNA。 （6）取10μL 样品进行电泳检查（Marker为λ DNA/HindⅢ酶切），剩余样品-20℃保存。 细菌16S rRNA基因V3区扩增 取2.0 μL 基因组DNA作为PCR模板，按照表顺序和体积将反应液加入0.5mL薄壁PCR管中，总体积5μL。引物1： 5’-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG-3’ 引物2： 5’-ATTACCGCGGCTGCTGG-3’ (μL) 终浓度 模板 2.0 -- 引物μM) 1.0 0.2 μM 引物μM) 1.0 0.2 μM 10×PCR Buffer （含Mg2+） 5.0 1× 10 mM dNTPs 1.0 0.2 mM Taq聚合酶轻轻混匀瞬间离心，放入PCR仪进行扩增，共3个循环。 PCR反应条件：94℃，min，预变性； 94℃，1min变性； 52℃，1min退火； 72℃，3min延伸； 72℃，5min，最后一次延伸。 PCR总时间约3.5 hμL 样品进行电泳检查（Marker为DL2000），剩余样品-20℃保存。 变性梯度凝胶电泳图谱分析微生物菌群 30%丙烯酰胺储备液℃。 1×TAE：0.04 M Tris，0.02 M HAc，0.05 M EDTA，pH 8.0。 10%过硫酸铵（APS）：0.1g APS溶于1.0mL水，-20℃保存一周。 四甲基乙二胺（TEMED），去离子甲酰胺 含变性剂8%丙烯酰胺液×TAE； 高浓度变性剂：4.2mL 30%储备液+3.84mL去离子甲酰胺+4.032g尿素+8.0mL 1×TAE。 （1）将丙烯酰胺储备液放置至室温，安装胶板注射器分别配制含%和60%的变性剂的8%胶溶液。的胶溶液各1mL加入比色管中，各加入1μL的TEMED和1μL的10%的APS，迅速混匀并吸入注射器中。 装胶，。放上梳子，凝固1h。 （4）配制7L的1×TAE并微波预热60℃。打开搅拌器设定60℃加热。 取出梳子，清洗上样孔。 关闭循环泵，上样。 160V电泳h。 染色。 观察并拍照。