幽门螺旋杆菌致胃上皮细胞氧化性DNA损伤和APE-1表达关系的体外实验的研究.pdf

摘要 IHIIIIHIHMl mIIII 111．11l 摘要 Y2427543 目的： 人类嘌呤／脱嘧啶核酸内切酶(APE．1)是修复氧化性DNA碱基损伤关键酶， 具有氧化还原作用，是重要的转录调节因子，在修复由活性氧(ROS)引起的 DNA损伤碱基切除修复通路中发挥核心作用。幽门螺旋杆菌(Hp)感染细胞可 氧化性DNA损伤中的作用尚不明确。因此，我们以不同浓度的Hp及在不同时 及其APE．1的表达，以探讨Hp的致病机制致。 方法： 1、GES．1细胞培养：GES．1细胞培养采用含10％的胎牛血清、2％的青链霉 素的高糖DMEM进行细胞培养，在Hp感染GES．1细胞之前细胞培养基换用无 青莲霉素的含10％胎牛血清的高糖DMEM进行培养。 VaeA+)标准菌株，制备Hp活菌悬液，并进行鉴定。 3、Hp感染GES．1细胞模型的建立：采用对数生长期的Hp感染GES．1细 4、DNA损伤检测：采用单细胞凝胶电泳彗星实验检测DNA损伤和Elisa 方法测量8．OHdG含量。 5、ROS水平检测：装载荧光探针荧光显微镜下观察细胞内ROS变化和荧 光酶标仪定量测量细胞内ROS含量。 6、APE．1蛋白表达的检测：用Westem Blotting、免疫细胞化学检测APE．1 蛋白表达变化和APE．1细胞内定位情况。 结果： 细胞DNA损伤逐渐加重，随着时间延长彗星拖尾越明显，即损伤越明显，细菌 细胞比为100：1感染至24h时彗星拖尾最长，DNA损伤最重(图3．1，表3．1)， 6h时， 各时间点之间差异有统计学意义(P0．05)；不同浓度Hp感染GES．1 摘要 Hp浓度越高，拖尾越明显，DNA损伤越重(图3．2，表3．2)，各浓度组之间差 异有统计学意义(P0．05)。8-OHdG含量相比空白组逐渐增加，随着时间延长 量最高(图3．5，表3．4)，差异有统计学意义(PO．05)。 ROS定量检测发现，24h内空白组ROS含量无明显，差异无统计学意义，细菌 细胞比为100：1时，ROS含量随感染时间延长而逐渐增加，至感染24h时ROS 含量达最大值(图3．6，表3．5)，差异有统计学意义(P0．05)；不同浓度Hp 感染GES．1时，相比空白组ROS含量均增加，且Hp浓度越高ROS含量越高， 至细菌细胞比为300：1时ROS含量最高(图3．8，表3．6)，各浓度组差异有统计 学意义(P0．05)。 GES．1细胞随时间变化未表现出明显变化，APE—l蛋白表达灰度基本一致，通过 灰度值分析差异无统计学意义；Hp感染GES．1以细菌细胞比为100：1时，APE—l 蛋白灰度值变化随时间延长逐渐加深，至Hp感染GES．1细胞12h时灰度最深， 感染24h时明显低于12h灰度，通过灰度值分析软件可得出APE．1在感染GES．1 12h时APE．1蛋白表达最高(图4．2，图4．3)，各时间组差异有统计学意义(P 4．4，图4．5)，差异有统计学意义(PO．05)．另外通过免疫细胞化学结果，APE．1 在细胞质中表达，Hp感染细胞后APE．1表达逐渐增加，染色逐渐加深，至感染 12h时染色最深，感染至24h时染色低于12h染色，通过平均光密度值分析，随 时间变化光密度值逐渐增加，感染24h的光密度值低于感染至12h的光密度值 6h，感染Hp的细胞染色较空白组深，且Hp浓度越高染色越深，至300：1时染 色最深(图4．9，表3．8)，通过平均光密度分析，空白组低于实验组光密度值， Hp浓度越高光密度值越高，差异有显著统计学意义(P0．05)。 结论： 通过体外实验表明，Hp感染GES．1细胞可引起细胞内ROS含量增加、DNA 摘要 损伤加重和8-OHdG含量增加，均与感染Hp浓度和感染Hp时间呈正相关。