益气活血中药复方治疗CVB-%2c3-病毒性心肌炎实验的研究.pdf

辽宁中医药大学二00九届博士学住论文 摘 要 研究目的： 病毒性心肌炎是指由多种病毒感染引起，以心肌细胞变性、坏死、间质炎性细胞浸 润和纤维渗出为主要改变的心肌疾病。其致病病毒以柯萨奇B组病毒(CVB)最为主要， 而在CVB的六个血清分型中，CVB。具有强嗜心性，因此，当前主要针对CVB。感染建立病 毒性心肌炎模型来开展各项研究，本课题选择病毒性心肌炎作为研究对象的主要原因 是，本病自身有很高的危害性，如小儿及成人的各个年龄阶段均可累及患病，急性期过 后，又有演变为扩张型心肌病的可能性，同时，也可引起小范围爆发流行，而近年病毒 性心肌炎的发病率更是呈现上升趋势，因此，针对CVB。病毒性心肌炎的治疗机制研究显 得迫在眉睫。 本课题以新生2—3d大鼠体外心肌细胞培养建立CVB。感染的VMC模型：通过 肌炎细胞感染模型心肌细胞功能、形态学改变；激光扫描共聚焦显微镜实时动态检测心 肌细胞游离Ca2+变化及细胞间缝隙连接通讯功能。试图验证益气活血中药复方具有减轻 CVB。病毒性心肌炎心肌细胞免疫损伤；抑制心肌细胞凋亡发生；调节细胞内游离Ca+浓 度；改善细胞间缝隙连接通讯；修复心肌细胞骨架及超微结构的作用，进一步证实益气 活血中药复方是治疗CVB。病毒性心肌炎的有效方剂，益气活血法是治疗本病的有效方 法。 材料与方法： ①益气活血中药复方细胞毒性测定：取复苏的Hela细胞，经培养瓶传代后，以每孔0．2ml 贴壁生长时，测益气活血中药复方最大无毒剂量。用DMEM培养液将益气活血中药复方 注射液从原液开始配制成11个浓度。每孔0．2ml，每个浓度设4个复孔，另设4个加正 常生长液的对照孔。分别于24h、48h观察细胞生长状态，参考正常对照孔细胞形态， 以不引起细胞病变的最大药物稀释浓度为最大无毒浓度(TD。)。@CVB。病毒毒力滴定： 一，每孔0．1ml，接种于96孔培养板中，每个浓度设4个复孔，另设4个正常对照孔， 益气活血中药复方治疗CVB，病毒性心肌炎的实验研究 病变情况。⑧益气活血中药复方对CVB。致心肌细胞死亡的抑制实验(MTT法)：取对数生 长期心肌细胞，每孔加入0．2ml半数组织感染量浓度CVB。病毒吸附心肌细胞2h。吸弃 含病毒培养液，以含2％胎牛血清的维持液轻轻洗涤一遍后，加入从药物最大无毒剂量 起始稀释8个浓度的含益气活血中药复方的生长液，每孔0．2ml，每个浓度设4个复孔， MTT溶液， 另设1个调零孔。于48h后，每孔加入0．18mlDMEM培养液，再加入0．02ml 放入培养箱继续培养4h，小心吸弃孔内培养液，每孔加入0．15miDMSO，置振荡器上振 荡8min，于酶联免疫检测仪490D_m处测量各孔的吸光值(0D)。④益气活血中药复方 对CVB。病毒性心肌炎心肌细胞凋亡的影响：正常分离培养乳鼠心肌细胞，接种于24孔 培养板做细胞爬片，48h后取单层贴壁生长达70—80％的正常组、病毒组、中药干预组 1．t 孔加入Hoechst33258染色液lml(5 3min，滴加0．05ml抗荧光淬灭封片剂做封片处理，于荧光显微镜下观察。⑤益气活血 。￡ 二 洗。滴加正常山羊血清封闭液，室温孵育15分钟，倾去，勿洗。滴加1：100比例稀释 0 显色，自来水冲洗，苏木素复染，脱水、透明处理，树脂封片，镜下观察。⑥透射电镜 检测益气活血中药复方对CVB。病毒性心肌炎心肌细胞超微结构的影响：正常培养心肌细 电镜检查。⑦荧光漂白恢复(FRAP)检测CVB。病毒性心肌炎心肌细胞间缝隙连接通讯功