SDSPAGE电泳分离蛋白质与蛋白质免疫印迹详解.ppt

SDS－PAGE电泳分离蛋白质与蛋白质免疫印迹 蛋白免疫印迹杂交（Western Blot ）是将蛋白样本通过聚丙烯酰胺电泳按分子量大小分离，再转移到杂交膜（blot）上，然后通过一抗/二抗复合物对靶蛋白进行特异性检测的方法。WB是进行蛋白质分析最流行和成熟的技术之一。 原理 聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(Acr)和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺(Bis)在加速剂N，N，N?，N?—四甲基乙二胺(简称TEMED)和催化剂过硫酸铵(简称AP)作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)。 30%丙烯酰胺的配制 1、称量Acrylamide290g，Bis10 g，置于1 L烧杯中 2、向烧杯中加入约600 ml的去离子水，充分搅拌溶解。 3、 加去离子水将溶液定容至1 L，用0.45 mm滤膜滤去杂质。 4. 于棕色瓶中4℃保存。 注意：丙烯酰胺具有很强的神经毒性，并可通过皮肤吸收，其作用具有积累性，配制时应戴手套、口罩等。聚丙烯酰胺无毒，但也应谨慎操作，因为有可能含有少量的未聚合成份。 凝胶浓度(T)的选择与被分离物质分子量密切相关。 表3.4 分子量范围与凝胶浓度的关系 分子量范围 适用的凝胶浓度/(%) 蛋 白 质 ?10KD 20-30 1O-40KD 15-20 1O-100KD 10-15 100KD 5-10 ?500KD 2-5 分离胶的聚合（12%） 5ml体系 蒸馏水 1.634ml 30%丙烯酰胺 2.0ml 1.5MpH8.8 Tris-SDS 3.7ml 10%AP 25ul TEMED 5ul 上层加异丙醇压胶，室温一小时 积层胶的聚合（5%） 2.5ml体系 蒸馏水 1.75ml 30%丙烯酰胺 0.413ml 1MpH6.8 Tris-SDS 0.338ml 10%AP 12.5ul TEMED 2.5ul 室温一小时 过程图48/newkj/my/moban2/index.htm （二）方法 1、制胶：制备凝胶板，将混合后的分离胶溶液，用1ml枪加至距梳齿下缘约1 cm。用1 mL枪在凝胶表面沿短玻璃板边缘轻轻加一层异丙醇(约高3–4 mm)，用于隔绝空气，使胶面平整。 约30-60 min凝胶完全聚合，则可看到水与凝固的胶面有折射率不同的界线。 将异丙醇倒去用重蒸水洗净胶面，将混合均匀后的浓缩胶溶液加入分离胶上方，轻轻插入梳子. 待上层胶聚合，拔出梳子，放入电泳槽，加入电极缓冲液，使液面没过短玻璃板约0.3 cm，即可加样。 2、样品处理： 样品经反复冻融裂解，离心，测浓度后，向样品中加入适量的上样缓冲液6*SDS，金属浴105°C 10min，加样量一般每个样品池10~40?l。 3、电泳 将电泳仪与电源接通，打开电泳仪稳流，开始时电流约20mA，待样品进入分离胶后，将电流调至25-30 mA，当溴酚蓝染料距底框0.5cm时，停止电泳，关闭电源 4、染色与脱色 电泳结束后，取下凝胶板，用胶铲撬开短玻璃板，从凝胶板上切下一角作为加样标记。加入染色液染色1-2 h，再加自来水(加几滴3MKCl)煮沸三次(10min/次)脱色，则可见蛋白质区带清晰。 5、转移电泳： 凝胶电泳结束前30min，将PDVF膜浸泡在转移缓冲液中。从模具中取出凝胶放在PDVF膜上，驱除气泡，然后置于滤纸上放入转移模具中，将模具放入转移电泳槽， PDVF膜一面朝正极，恒压1