粘质沙雷氏菌几丁质酶chiB基因分离和表达的分析.pdf

摘要 几丁质及其水解产物在病虫害防治、医药生产和饲料加工等多个领域具有广 泛的用途，其专一性水解酶——几丁质酶(chifinase)已成为当前研究的热点，分 离新的几丁质酶基因、构建高效表达工程菌，对实现几丁质酶产业化具有重要意 marcescens)分离chiB 义。本文采用PCR技术，从粘质沙雷氏菌(Serrat$a 基因，并分析了该基因的DNA序列，构建了原核生物表达载体，通过IPTG诱 导表达，分别对该基因表达的蛋白产物进行了SDS分析、生物活性和功 能分析。结果表明： 1．依据己克隆的chiB基因序列的同源性比较，设计了三对PCR扩增引物，采 用PCR技术，从粘质沙雷氏菌基因组中分离出一个大小约1500bp的特异 DNA片段； 2．通过特异片段的测序和与报道的chiB基因的序列同源性分析，结果显示， 1118rcesceBs 该克隆片段是阅读框为1500bp的功能基因，与Serratia 基因同源性较低，初步表明该片段是粘质沙霄氏菌几丁质酶ehiB基因； 所克隆的基因chiB已置于表达载体的正确阅读框架下； 4． 表达载体pET．chiB经诱导表达，结果显示其表达的蛋白为可溶性蛋白，经 SDS分析，结果表明该基因表达的蛋白分子量为52kDa； 5．通过对表达载体的SDS各种参数包括时间、温度和IPTG浓度诱导 表达分析，结果显示最佳诱导时间为3～4小时；最佳诱导IPTG浓度为 0．5mmol／L：20℃～30℃为诱导表达的适宜温度，并以25℃为最佳； 6． 以酵母菌为指示菌做抑菌圈试验，结果显示经不同浓度的IPTG诱导表达的 mmol／L时 蛋白液处理后，抑菌圈大小变化十分显著，并在IPTG浓度为O．5 抑菌效果最明显。 7．通过对经不同浓度的IPTG诱导表达的几丁质酶活力测定结果显示，当IPTG 浓度为O．5mmol／L时，几丁质酶活力达到最大值68．7U／ml，远高于原菌液几 丁质酶表达的酶活力11．63U／ml。 综上所述，本文已成功地从粘质沙雷氏菌中分离出几丁质酶chiB基因，并 构建了高效原核表达载体pET．chiB，同时优化了该工程菌诱导表达的参数，这 些结果为几丁质酶基因的进一步研究和几丁质酶的产业化生产奠定了良好的前 期工作基础。 I 关键词：chiB基因；克隆；生物信息学；工程菌；SDS分析；抑菌试验； 酶活测定 II Abstract Chitinandits extensive have usesinalotofdomainssuchas hydrolysate and the cureof diseasesandinsect and prevention plant pests，medicineproduction fodder its chitinase has becomethe machining，etc．Andsinglehydrolase--thealready of current newchitinaseand the hotspot research．Separatinggenesconstructing bacteriathatCan