生化常用分子生物学技术的原理及应用.ppt

二、蛋白质组学的研究内容 总体上可以分为对蛋白质表达模式的研究即蛋白质组组成的研究和对蛋白质组功能模式（目前主要集中在蛋白质相互作用网络关系）的研究两个方面 * * * * (Sanger双脱氧链终止法) HO P O P O P O CH2 O O O OH OH OH O A, C, G or T 1′ 3 ′ OH α β γ 5 ′ 双脱氧核苷三磷酸 脱去 DNA链末端合成终止法 Sanger 1958年和1980年两次获Nobel奖 DNA链末端合成终止法 DNA自动测序 用荧光替代放射性核素标记是实现DNA序列分析自动化的基础。 用不同荧光分子标记4种ddNTP，然后进行Sanger测序反应，产物经电泳（平板电泳或毛细管电泳）分离。 通过4种激光激发不同大小DNA片段上的荧光分子使之发射出4种不同波长荧光，检测器采集荧光信号，并依此确定DNA碱基的排列顺序。 DNA自动测序结果 四、几种重要的PCR衍生技术 （一）反转录PCR技术 (RT-PCR) （二）原位PCR技术 (ISP) （三）实时PCR技术 (real time PCR) RT-PCR技术 AAnA TTnT 5′ 5′ mRNA 反转录酶 mRNA cDNA 3′ TTnT AAnA 核糖核酸酶H TTnT 3′ DNA poly I cDNA 核酸酶S1 双链cDNA 3′ 5′ 3′ 5′ 5′ 加热变性 加入特异性引物 DNA聚合酶 PCR 扩增出大量的产物 实时PCR技术原理 第 3 节转基因技术与基因剔除技术 是指将外源基因整合到动物细胞或植物细胞的基因组中并使外源基因在动物细胞或植物细胞中稳定遗传和表达的技术。 基因的导入方式主要： 显微注射法 胚胎干细胞法 逆转录病毒感染法 一、转基因技术 即体细胞克隆技术，是用显微操作、电融合等方法将动物体细胞的细胞核全部导入另一个个体的去除细胞核的卵细胞内，使之发育成为个体。 二、核转移技术 核转移技术可使一个细胞变成一个个体，这样产生的个体所携带的遗传物质与细胞核供体的遗传物质完全一样，是一种无性繁殖的过程，即克隆(clone)。 通过分子生物学的方法定向地敲除动物体细胞内的某个基因的技术称为基因剔除 (gene knock-out)或基因打靶 (gene targeting)。 三、基因剔除技术 四、基因转移和基因剔除在医学中的应用 （一）建立疾病动物模型 （二）生物制药 （三）治疗性克隆和生产可用于人体器官 移植的动物器官 第 4 节??? 生 物 芯 片 技 术 DNA芯片(DNA chip)、DNA阵列(DNA array) cDNA芯片(cDNA chip) 指将许多特定的DNA片段或cDNA片段作为探针，有规律地紧密排列固定于单位面积的支持物上。 一、基因芯片(gene chip) 将探针与荧光标记的待测样品分子进行杂交，通过检测系统检测杂交的荧光信号和强度，从而获取样品分子的数量和序列信息。 将高度密集排列的蛋白分子作为探针点阵固定在固相支持物上，当与待测蛋白样品反应时，可捕获样品中的靶蛋白，再经检测系统对靶蛋白进行定性和定量分析的一种技术。 二、蛋白质芯片 (protein chip) 又称蛋白质阵列 (protein array) 基本原理： 蛋白质与蛋白质分子之间在空间构象上能特异性的相互识别和相互结合。如抗体与抗原或受体与配体之间的特异性结合。 最常用的探针： 抗体，抗体与抗原结合的特异性最强。 检测方法： 标记检测法、直接检测法 第5节 蛋白质相互作用研究技术 1989年美国纽约州立大学的Fields和Song首先描述了酵母双杂交系统(yeast two-hybrid system)。 该系统的建立是基于对酵母转录因子Gal4分子的研究。 转录激活因子 DNA结合结构域(BD) (DNA binding domain) 转录激活结构域(AD) (activation domain) 一、酵母双杂交系统 （一）酵母双杂交系统的基本原理 N端 C端 这两个结构域各具功能，互不影响, 单独存在时没有转录激活的功能，只有两者通过共价或非共价键连接建立起来的空间结构方可表现出一个完整的激活特定基因表达的激活因子的功能。 （二）酵母双杂交系统的应用 1. 分