时间分辨荧光分析法副本.ppt

4.1 方法的灵敏度和稳定性 以零剂量点发光值均值减2SD 后的发光值在标准曲线上得到的相应值为检测的灵敏度，间接竞争AFB1-TRFIA 的灵敏度为0.01 μg/L。8 条不同时间进行的间接竞争AFB1-TRFIA 的效应点均值ED80、ED50、ED20 分别为（0.07±0.01）μg/L、（0.63±0.02）μg/L 和（12.5±0.47）μg/L。说明剂量反应曲线的位置漂移小，方法的稳定性好。 4.2 方法的特异性 采用间接竞争AFB1-TRFIA检测，黄曲霉毒素B2 与AFB1 有10%左右的交叉反应，而黄曲霉毒素G2、赭曲霉毒素A、赭曲霉毒素B 及HRP 对AFB1 无交叉反应，说明抗体的特异性较好。 4.3 方法的精密度和回收率 间接AFB1-TRFIA在0-100μg/L之间的批内和批间变异(CV)分别为4.1%和6.8%， 都符合批内CV5%和批间CV10%的要求，5 个添加样品的平均回收率为97.2%,见表1。 4.4 AFB1-TRFIA 与AFB1-ELISA 试剂盒的比较 玉米、小麦、大豆、棉籽粕等21 份样品经TRFIA和ELISA 产品同时检测，有4 份样品低于ELISA产品的测量下限，有2 份样品高于ELISA 产品的测量上限，有15 份样品在ELISA 和TRFIA 产品的共同可测范围之内。该15 份样品两者的相关系数为0.917，说明结果相符。 该方法对其他毒素的应用： 由于中药中真菌毒素的限量很低，非常适用于该检测，且已经得到一定的应用（见表3） 六、展望 由于TRFIA技术集酶标记、同位素标记技术的优点于一身:灵敏度高、特异性强、稳定性好,且测定范围更宽,试剂寿命长,操作简便和非放射性等特点,非常适用于生物学、医学上的超微量分析,是一项很有前途的、值得推广的技术,其应用范围不断发展已经成为临床及治疗监测和基础医学研究等方面的重要手段。 由于我国起步较晚，还面临着一些亟待解决的问题：大部分检测试剂如螯合剂、增强液等需要进口，过分依赖国外产品；国产分析仪器尚有软件操作繁琐，界面复杂等缺点。这些都极大地限制了TRFIA技术的推广，还需科研工作者努力解决。 谢谢观赏 时间分辨荧光分析法及其应用 目录 一、时间分辨荧光分析法的基本概念 二、时间分辨荧光分析法基本原理与优点 三、时间分辨荧光分析技术简介 四、时间分辨荧光分析法的应用 五、时间分辨荧光免疫分析技术在真菌毒素检测 方面的应用 六、展望 一、基本概念： 1.有些物质受到光的照射时，除吸收某种波长的光之外还会发射出波长相同或比吸收波长更长和的光，这种现象称为光致发光。最常见的光致发光现象是荧光和磷光。 2.物质分子吸收光子能量而被激发，然后从激发态的最低振动能级返回到基态时所发射出的光称为荧光(fluorescence)。 3.根据物质的荧光谱线位置及其强度进行物质鉴定和物质含量测定的方法称为荧光分析法(fluorometry)。 5.时间分辨荧光分析法（Time resolved fluoroisnmuno assay,TRFIA） 是近十年发展起来的非同位素免疫分析技术，是目前最灵敏的微量分析技术,其灵敏度高达10-19g/ml，较放射免疫分析（RIA）高出3个数量级。它用镧系元素标记抗原或抗体，根据镧系元素螯合物的发光特点，用时间分辨技术测量荧光，同时检测波长和时间两个参数进行信号分辨，可有效地排除非特异荧光的干扰，极大地提高了分析灵敏度。 二、时间分辨荧光分析法基本原理与优点 1.原理 TRFIA 是用镧系金属离子作为示踪物标记蛋白质、多肽、激素、抗体、核酸探针或生物活性细胞,与其螯合剂、增强液(有一部分不需要) 在待反应体系(如:抗原抗体免疫反应、生物素亲和素反应、核酸探针杂交反应、靶细胞与效应细胞的杀伤反应等) 发生反应后,用时间分辨荧光仪测定最后产物中的荧光强度,根据荧光强度和相对荧光强度比值,推测反应体系中分析物的浓度,达到定量分析的目的。 时间分辨荧光免疫原理图 2.优点 TRFIA 技术具有酶标记分析技术和同位素标记技术的优点: 具有灵敏度高、特异性强、稳定性好，且测定范围宽，试剂寿命长，操作简便和非放射性等特点： 镧系离子与螯合剂形成螯合物后，Stokes 位移能够达到 200 nm 以上，很容易分辨激发光和发射光，从而激发光干扰就可以排除。 镧系元素与通常的荧光物质相比较，镧系元素离子螯合物荧光的衰变时间要长的多，为传统荧光的 103～106倍。