实验菌种分离.ppt

实验二 食用菌母种分离 一、实验目标： 1、掌握组织分离法制备母种的方法。 2、掌握组织分离接种技术。 3、会使用超净工作台和培养箱。 二、实验原理： 组织分离法是利用子实体组织来分离获得纯培养菌丝的方法。 是一种无性繁殖，双亲的染色体没有经过重组，因此组织分离基本上可保持亲本的生物学特性。 三、仪器设备与材料 PDA斜面培养基、解剖刀、镊子、超净工作台、无菌室、酒精灯、培养箱。 香菇 四、制种程序 3、常用的消毒设备： （1）70%酒精：一般用于手、种菇表面消毒； （2）0.1%升汞：常用于玻璃器皿、非金属器械及种菇表面消毒； （3）0.1%KMnO4：一般用于用具、器皿消毒； 2、木腐菌基内菌丝分离 ①把分离用菇木的部分或全部的表面在火焰上轻燎。 ②取小刀在火焰上灭菌，对准菇木上菇柄的着生位置切成两半。 ③确定欲分离菌丝在菇木上的位置，再次用火焰灭菌过的小刀，在欲分离部位刻划数个井字。 ④用火焰灭过菌的接种钩，钩取一小块木屑移接于斜面培养基。 ⑤接种后将试管置于25~27℃下培养，促使其恢复。近风干的种木内菌丝常处于休眠状态。 3、孢子分离孢子分离主要是指利用子实体上产生的成熟有性孢子分离培养获得纯菌种的方法。分为多孢分离与单孢分离两种。 3、自然基质保藏法 4、菌丝球保藏法： 5、滤纸保藏法 6、真空冷冻干燥保藏法 7、液氮超低温保藏法 九、操作步骤 1、挑选种菇：挑选生长健壮，菌聆年龄适中，无病虫害，具有本品种优良性状的固体或组织作为种菇。 2、环境、用具严格消毒： 打开紫外灯，30min后关闭杀菌灯。 3、用75%的酒精棉球对手指和菌种试管外壁消毒。 4、点燃酒精灯。 5、蘑菇体消毒 将子实体菌柄基部切除，置接种箱内，在超净工作台上以75%的酒精擦拭，进行表面消毒。 6、组织分离： 解剖刀经火焰灭菌，在蘑菇柄中纵切一刀，用手掰开再用刀片在菇盖与菇柄交界处切黄豆大小的小方块，放入培养皿中。 7、左手拿试管，用左手的大拇指和其他四指并排握住，斜面向上，并使试管位于水平位置。 8、右手拿镊子，在火焰上将凡在接种过程中可能进入试管的部分全部用火烧过。 9、用右手小指和无名指及手掌拔掉胶塞。用火焰灼烧试管口，灼烧时应不断转动管口。将烧过的镊子，稍微停留片刻，使之冷却，然后夹取小块迅速移接到斜面培养基中央，并塞好塞子。 10、贴标签 写明菌种编号，接种日期，姓名，随后放入培养箱中，置适宜温度下培养，待组织块长出菌丝无污染即为纯种。 培养3~5天，就可以看到组织上产生白色绒毛状菌丝，转管扩大即得到菌种。 十、结果 1、记录你制作的母种的生长状态； 2、是否有杂菌污染，如有分析其原因。 2、矿油保藏法 无菌检验 注入种管 淹没斜面约1cm 矿油处理 灭菌：152kpa、30min去水：40~50℃烘至无色透明 口堵胶塞 用时转管再转管 （三）保藏注意 用保种培养基 及时保藏（菌丝占斜面2/3） 最好换胶塞 用时活化 严防棉塞受潮 * 1、接种工具 枪 匙 钩 铲 镊 耙 针 环 接种 五、菌种生产常用的设备和方法 固体菌种接种枪 液体菌种接种枪 2、接种设备 （1）接种室 （2）接种箱 （3）超净工作台 4、菌种培养没备 （1）培养箱培养少量菌种的恒温电器（20~40℃） （2）培养室 六、菌种分离的方法 菌种分离：将有价值的子实体的局部组织、孢子或基内菌丝移接到斜面试管培养基上，获得纯培养菌丝的操作称为菌种分离。 必备 特点 简便，易成功 保持原菌种性状 重复多易退化 不适于耳类 1、组织分离：采用食用菌子实体或菌核、菌索的任何一部分组织培养成纯菌丝体的方法。 组织 PDA 次生菌丝 培养 孢子特点 菌龄小生命力强变异率高 （1）种菇 消毒 菌柄去2/3 苞被 有：75%酒精棉球擦 0.25%新洁尔灭浸2~3min无菌纱布吸干表面水分 无 （2）采收孢子 整菇插种法 种菇插在孢子收集器中使孢子散落于培养皿内的方法 用前灭菌 25℃、24h现孢子粉取出分离材料培养皿盖严 ①钩悬法 生产上采集木耳、银耳的孢子常采用此法。 25℃、24h现孢子粉取出分离材料 ②孢子印法 取成熟的伞菌或胶质的子实体，经表面消毒，切去菌柄，菌褶向下，放置于灭过菌的有色纸上，用通气钟罩上，静置一天，孢子落在纸上，形成孢子印，再从中挑取少量孢子转入试管培养基上培养。 接种孢子 用接种环蘸孢子液或孢子粉涂布于平板上 七、菌种质量的鉴定 形态特征、生理特性、栽培性状、经济效益等 鉴定项目 、 一般从菌种的纯度、长势、颜色、菌龄、均匀度和出菇快慢等6个方面进行鉴定。 退化母种 好母种 出菇试验 栽培 出菇快产量高品质好抗逆性强 菌种种类 品种名称 菌种级别 代 时