实验三间接ELISA.ppt

免疫酶标记技术是继免疫荧光抗体技术和放射免疫分析之后发展起来的一大新型的血清学技术。目前，免疫酶标记技术已成为免疫诊断、检测和分子生物学研究中应用最广泛的免疫学方法之一。 酶联免疫吸附试验 (enzyme-linked immunosorbent assay , ELISA) 一、基本原理 它采用抗原与抗体的特异反应将待测物与酶连接，然后通过酶与底物产生颜色反应，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，由此进行定性或定量分析。测定的对象可以是抗体也可以是抗原。 在这种测定方法中有3种必要的试剂： ①固相的抗原或抗体（免疫吸附剂） ②酶标记的抗原或抗体（标记物） ③酶作用的底物（显色剂） 酶标抗体技术的基本程序 1、将酶分子与抗原或抗体分子共价结合 2、将酶标抗体(抗抗体)与吸附于固相载体上的抗原(抗体)发生特异性结合，并洗下未结合的物质 3、滴加底物溶液后，底物在酶作用下水解呈色；或者底物不呈色，但在底物水解过程中由另外的供氢体提供氢离子，使供氢体由无色的还原型变为有色的氧化型，呈现颜色反应。因而，可根据底物溶液的颜色反应来判定有无相应的抗原抗体反应。 间接ELISA 间接法是检测抗体最常用的方法，其原理为利用酶标记的抗抗体以检测已与固相结合的受检抗体。 底物显色反应 抗原包被 一抗反应 二抗反应 基本流程 结果测定 一、抗原包被 固相载体 聚苯乙烯具有较强的吸附蛋白质的性能，抗体或蛋白质抗原吸附其上后仍保留原来的免疫学活性。 良好的ELISA板应该是吸附性能好，空白值低，孔底透明度高，各板之间、同一板各孔之间、同一板各孔之间性能相近。 蛋白质与聚苯乙烯固相载体是通过物理吸附结合的，靠的是蛋白质分子结构上的疏水基团与固相载体表面的疏水基团间的作用。 包被用抗原：天然抗原、重组抗原和合成多肽抗原三大类 包被条件 包被液 pH9.6碳酸盐缓冲液 pH7.2的磷酸盐缓冲液 pH7-8的Tris-HCL缓冲液。 加入包被液后，在4-8℃冰箱中放置过夜，37℃中保温2小时。包被浓度随载体和包被物的性质可有很大的变化，每批材料需通过实验与酶结合物的浓度协调选定。一般蛋白质的包被浓度为10ng/ml-20ug/ml。 二、封闭 封闭(blocking)是继包被之后用高浓度的无关蛋白质溶液再包被的过程。封闭就是让大量不相关的蛋白质充填这些空隙，从而排斥ELISA后的步骤中干扰物质的再吸附。 常用封闭剂：0.05%-0.5%的BSA; 10%的小牛血清或1%明胶;脱脂奶粉,比较价廉，可以高浓度使用（5%）。 三、洗涤 　　在板式ELISA中，常用的洗涤液为含0.05%吐温20磷酸盐缓冲液。 四、一抗反应 　　常用抗体：血清、单抗、体液等，常用封闭液稀释后使用。 酶标记的抗抗体是ELISA中关键的试剂。常用辣根过氧化物酶（HRP）标记抗体。用封闭液稀释后使用。（2000-8000倍稀释） 五、二抗反应　 六、底物反应 HRP的底物： 四甲基联苯胺(TMB)， H2O2为受氢体。 TMB经HRP作用后产物显蓝色。TMB性质较稳定，可配成溶液试剂，只需与H2O2溶液混和即成应用液。酶反应终止后，TMB产物由蓝色呈黄色，可在比色计中定量，最适吸收波长为450nm。 常用的HRP反应终止液为硫酸，其浓度按加量及比色液的最终体积而异，在板式ELISA中一般采用2mol/L。 七、 结果判断 ELISA检测仪，读每孔的OD值。 A.阳性判定值： （cut-off value）一般为阴性对照A值加上一个特定的常数(0.05)，以此作为判断结果阳性或阴性的标准。 B.标本/阴性对照比值：在实验条件（包括试剂）较难保证恒定的情况下，这种判断法较为合适。在得出标本（S）和阴性对照（N）的A值后，计算S/N值大于等于2。 猪圆环病毒2-dCap-ELISA抗体检测试剂盒 用于检测猪血清中抗猪圆环病毒2型Cap蛋白抗体，评价PCV2疫苗的免疫效果和感染猪的血清学诊断。 PCV编码蛋白 电镜下观察PCV病毒粒子 ORF3：凋亡相关蛋白，与病毒的体内外致病力相关 ORF1：编码病毒复制相关蛋白Rep和Rep’ ，促进PCV 的复制 ORF4：抑制凋亡相关蛋白 ORF2: 编码衣壳蛋白Cap，与病毒的毒力相关