核酸扩增技术.ppt

核酸扩增技术 温州医学院 检验医学院、生命科学学院 主要内容 第一节 聚合酶链反应技术 第二节 荧光定量PCR技术 第三节 其他核酸扩增技术 第四节 临床基因扩增实验室的管理与质量控制 第一节 聚合酶链反应技术 polymerase chain reaction, PCR 一、 PCR技术发展简史 二、 PCR技术原理 三、 PCR反应体系、条件及其优化 四、扩增产物检测及分析 五、 PCR常见问题与原因分析 六、PCR衍生技术 PCR技术发展简史 Korana于1971年最早提出核酸体外扩增的设想。 1985年Mullis等发明了具有划时代意义的聚合酶链反应，使用的DNA聚合酶是Klenow片段。 PCR技术发展简史 1988年初，Keohanog改用T4 DNA聚合酶进行PCR。 1988年Saiki 发现Taq DNA聚合酶，从此PCR技术得以广泛应用。 PCR反应体系、条件及其优化 PCR反应体系 模板（template） 引物（primers） DNA 聚合酶 (DNA polymerase) dNTP PCR缓冲液（PCR buffer） PCR反应条件 变性 退火 延伸 循环 DNA RNA：总RNA、mRNA、tRNA、 rRNA、 病毒RNA 引物（primers) 引物是人工合成的两段寡核苷酸序列，一个引物与感兴趣区域一端的一条DNA模板链互补，另一个引物与感兴趣区域另一端的另一条DNA模板链互补。 引物的重要性 在整个PCR体系中, 引物占有十分重要的地位。PCR的特异性要求引物与靶DNA特异结合，不与其他非目的DNA结合，PCR的灵敏性要求DNA聚合酶能对引物进行有效的延伸，可见引物设计好坏与PCR结果密切相关。 引物设计总原则 引物与模板的序列要紧密互补 引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构 引物不能在模板的非目的位点引发DNA 聚合反应(即错配)。 引物设计一般原则 引物长度 碱基分布的均衡性 Tm值 引物二级结构 引物3’端 引物5’端 引物的内部稳定性 引物的保守性与特异性 扩增区域的二级结构 引物长度 一般为15-30个核苷酸，常用的是18-24 bp。在做长片段PCR或做某些特殊的PCR时应使用较长的引物，但最多不超过50个核苷酸。 引物过短会引起错配现象，一般来说引物长度大于16bp是必要的（不容易引起错配）。例如：一个长度为12bp的引物在人类基因组上存在200个潜在的退火位点(3 x 109/412=200 ).而一个长度为20bp的引物在人基因组上存在的退火位点只有1/400个. 较长的引物（28-35bp)一般是用来区分同源性较高的模板序列或者使用于产生一些突变位点 碱基分布的均衡性 GC含量一般40-60%，推荐45-55%或50-60%。上下游引物的GC含量不能相差太大。 GC含量太低导致引物Tm值较低，使用较低的退火温度不利于提高PCR的特异性 GC含量太高也易于引发非特异扩增。 同一碱基连续出现不应超过5个 引物Tm值 一般要求：55℃-65℃。 计算： 对于低于20个碱基的引物，Tm值可根据Tm=4(G+C)+2(A+T)来粗略估算 对于较长引物，Tm值则需要考虑热动力学参数，从“最近邻位”的计算方式得到，这也是现有的引物设计软件最常用的计算方式。 Tm = △H/(△ S + R * ln (C/4)) + 16.6 log ([K+]/(1 + 0.7 [K+])) - 273.15　　 引物二级结构 引物二聚体 尽可能避免两个引物分子之间3’端有有较多碱基互补 发夹结构 尤其是要避免引物3’端形成发夹结构，否则将严重影响DNA聚合酶的延伸。 引物3’端 引物的延伸从3’端开始，因此3’端的几个碱基与模板DNA均需严格配对，不能进行任何修饰，否则不能进行有效的延伸，甚至导致PCR扩增完全失败。考虑到密码子的简并性，引物3’端最后一个碱基最好不与密码子第三个碱基配对。引物3’端不要出现3 个以上的连续碱基，如GGG 或CCC，否则会使错误引发机率增加。 引物3’端的末位碱基对Taq 酶的DNA合成效率有较大的影响。不同的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率，末位碱基为A 的错配效率明显高于其他3 个碱基，因此应当避免在引物的3’端使用碱基A。 引物5’端 引物5’端可以有与模板DNA不配对碱基，在5’端引入一段非模板依赖性序列。 5’端加上限制性核酸内切酶位点序列（酶切位点5’端加上适当数量的保护碱基）。 5’端的某一位点修改某个碱基，人为地在产物中引入该位点的点突变以作研究。 5’端标记放射性元素或非放射性物质（如生物素、地高辛等）。 引物的保守性与特异性 保守性：通用引物——检测同一类病原微